金黄色葡萄球菌磷酸二酯酶GdpP的结构与功能研究
发布时间：2020-09-17 12:20
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是自然界中广泛存在的一种重要的病原菌,可引起许多严重感染,属于革兰氏阳性菌。环二腺嘌呤核苷酸(c-di-AMP)是革兰氏阳性菌中广泛存在的第二信使分子,对于细菌胞内钾离子运输,脂肪酸合成,细胞壁的稳态及生物被膜的形成等都具有重要的调控作用。细菌胞内c-di-AMP的合成和降解分别受二腺苷酸环化酶(diadenylate cyclase,DAC)及磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)的调控。目前已知的降解c-di-AMP的磷酸二酯酶根据结构域可分为两类:(1)DHH-DHHA1结构域蛋白,包括GdpP及其同源蛋白以及Rv2837c类独立的DHH-DHHA1单结构域蛋白。(2)HD类催化结构域蛋白,其中GdpP类以及HD类PDE可将c-di-AMP降解成pApA,而只有Rv2837c类PDE可继续降解pApA为AMP。本论文主要内容为金黄色葡萄球菌中参与降解c-di-AMP的磷酸二酯酶GdpP的蛋白结构与功能研究。GdpP是第一类被鉴定出的能降解c-di-AMP的磷酸二酯酶,存在于多种革兰氏阳性菌中,在敲除GdpP的菌株中能检测到胞内c-di-AMP水平的显著增加。GdpP N端具有两个穿膜区,随后是一个PAS(Per-Arnt-Sim)结构域和一个退化的GGDEF结构域,C端为DHH-DHHA1催化结构域。GdpP能降解c-di-AMP和c-di-GMP生成pApA和pGpG,但是GdpP降解c-di-GMP的速率非常低。我们对GdpP全长,以及C端DHH-DHHA1结构域分别进行了蛋白表达纯化及结晶,最终获得了分辨率为2.2 A的C端DHH-DHHA1结构域(GdpP-C)蛋白晶体,通过X-射线衍射晶体学解析得到GdpP-C的蛋白结构。分析发现GdpP-C的结构与已知的DHH-DHHA1结构非常相似,都包含保守的DHH与DHHA1结构基序,两个结构域之间由一段柔性loop相连。DHH结构域包含一个由两个锰离子组成的酶活中心,同时与Rv2837c结构相比,参与双锰配位的氨基酸是高度保守的,表明GdpP-C具有相同的双锰降解机制。为了进一步阐明GdpP的催化水解机制,我们利用小分子浸泡晶体的实验方法得到了 GdpP-C蛋白与小分子c-di-AMP、c-di-GMP以及5'-pApA的三种复合物结构。复合物结构的分辨率分别为2.15 A、2.2 A和2.6 A。通过对GdpP-C以及三种复合物结构的比较分析,可以得出三种小分子以相同的伸展方向结合在GdpP-C的DHHA1结构域的相同位置,表明DHHA1结构域为底物识别结构域,但小分子的磷酸二酯键都远离位于DHH结构域的双锰活性中心,只有当中间的柔性loop区发生构象变化使DHH与DHHA1足够靠近时才可能发生降解反应。我们以之前实验室解析的活性状态的Rv2837c结构为模型模拟了活性状态下的GdpP-C的结构,在活性状态下三种小分子与DHHA1的结合没有发生变化,并且通过突变体酶活实验进一步证明了活性结构的可靠性。复合物结构充分展示了GdpP-C在降解底物过程中的底物结合以及产物生成的方式。结构分析显示GdpP-C结合底物的方式与Rv2837c有很大不同,鉴于之前我们实验室只拿到了Rv2837c降解c-di-AMP第二步反应的底物结合方式,因此我们大胆猜测GdpP-C的底物结合方式同样代表了 Rv2837c第一步降解过程的底物结合方式。我们将DHH-DHHA1蛋白的底物结合位点分为三个亚位点并分别命名为R,C和G。GdpP-C在其C和G位点上水解c-di-AMP生成pApA,而在Rv2837c中pApA可以继续翻转到C和R位点并进一步降解为AMP。通过突变体酶活实验证明,扩大GdpP-C的C位点和R位点可以使GdpP-C具有进一步降解pApA的能力,同时突变Rv2837c的G位点和R位点的关键氨基酸可以分别阻碍c-di-AMP第一步与第二步的降解反应。此外我们还发现C位点决定了 DHH-DHHA1特异性识别底物核苷酸的能力。结构分析及酶活验证揭示了 DHH-DHHA1蛋白家族具有统一的催化机制。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R378
【部分图文】：
但是不含功能性的ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ合成的酶［３５］。逡逑在生物体内ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ是由一种叫做二腺苷酸环化酶（ＤＡＣ）的蛋白质以ＡＴＰ逡逑或ＡＤＰ作为底物合成的（图１－１）。该种酶是一种具有环化酶结构域的蛋白质，逡逑它催化两分子ＡＴＰ或ＡＤＰ通过缩合反应，最后合成一分子的ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ［３５］。ＤＡＣ逡逑结构域是在研宄一种可以被用来观察染色体的病变的蛋白－ＤｉｓＡ的Ｘ射线晶体逡逑结构的研宄中被发现的［３６］。后来，在许多细菌和古细菌物种中发现含有ＤＡＣ结￥逡逑构域的蛋白质。ＤｉｓＡ，邋ＣｄａＡ，邋ＣｄａＭ和ＣｄａＳ是迄今为止己经确定了的四类ＤＡＣ逡逑结构域蛋白质。一般情况下一种生物仅含有一种类型的ＤＡＣ，但也有一些含有逡逑多种酶，例如梭菌属（Ｃ／ｏｓｆｒ砂ｗｗｓｐｐ），含有两种类型的ＤＡＣ邋（ＣｄａＡ和ＤｉｓＡ）逡逑以及枯草芽孢杆菌含有三种ＤＡＣ邋（ＤｉｓＡ，邋ＣｄａＳ和ＣｄａＡ）邋［３６３７】。逡逑所有的ＤＡＣ结构域蛋白都含有保守的氨基酸序列，相邻基因与各类ＤＡＣ逡逑的协同作用
ＧｄｐＰ是一个挂膜蛋白，为了进一步了解跨膜区位置（便于后继改造），逡逑我们用跨膜蛋白的预测网站（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ－２．０）对该逡逑蛋白进行了跨膜区域预测，其结果如图２－２所示：我们从预测结果可以看到，该逡逑蛋白的前５４个氨基酸是跨膜区域
我们为／进一步对载体进行构建，还使用ＤＮＡｓｔａｒ中的Ｐｒｏｔｅａｎ对ＧｄｐＰ疏水性进行了分析，其结果如图２－３所示，最下边一行为疏水性的分析，域在上边的位置是亲水性区域，黄色区域在下边的是疏水性区域，分析我发现该蛋白的Ｎ端具有较强的亲水性，所以在载体构建的过程中，尽量Ｎ端Ｔａｇ标签的载体。逡逑１邋Ｔ邋－邋｜邋■邋Ｉ邋＇邋Ｉ邋｜邋■邋，邋，邋邋邋｜邋，邋１邋｜逦！邋■邋Ｉ邋■邋｜逡逑Ｉ邋ｒ邋？－＊邋＊ｃ邋ａ邋＇Ｘ邋ｒ．邋－ｖ邋ｚ邋７ｒ．邋７ｉ邋＇ｆｔ邋ｘａ邋ｋ邋ｔｔ邋ｖ：邋ａ邋0邋＾邋ｍ邋ｖ：邋７．邋ｖ．邋ｎ邋％逦％逡逑＊＾鲁曷１１—１１＿邋？逦？邋—＾暑馨■（■軎？灥邋４ＭＩ邋州如：分逡逑＊１－邋Ｉ邋￣邋x哄巍觥鲥澹樱停湾澹俊鰺8暴１邋灥－．１■
本文编号：2820710
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R378
【部分图文】：
但是不含功能性的ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ合成的酶［３５］。逡逑在生物体内ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ是由一种叫做二腺苷酸环化酶（ＤＡＣ）的蛋白质以ＡＴＰ逡逑或ＡＤＰ作为底物合成的（图１－１）。该种酶是一种具有环化酶结构域的蛋白质，逡逑它催化两分子ＡＴＰ或ＡＤＰ通过缩合反应，最后合成一分子的ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ［３５］。ＤＡＣ逡逑结构域是在研宄一种可以被用来观察染色体的病变的蛋白－ＤｉｓＡ的Ｘ射线晶体逡逑结构的研宄中被发现的［３６］。后来，在许多细菌和古细菌物种中发现含有ＤＡＣ结￥逡逑构域的蛋白质。ＤｉｓＡ，邋ＣｄａＡ，邋ＣｄａＭ和ＣｄａＳ是迄今为止己经确定了的四类ＤＡＣ逡逑结构域蛋白质。一般情况下一种生物仅含有一种类型的ＤＡＣ，但也有一些含有逡逑多种酶，例如梭菌属（Ｃ／ｏｓｆｒ砂ｗｗｓｐｐ），含有两种类型的ＤＡＣ邋（ＣｄａＡ和ＤｉｓＡ）逡逑以及枯草芽孢杆菌含有三种ＤＡＣ邋（ＤｉｓＡ，邋ＣｄａＳ和ＣｄａＡ）邋［３６３７】。逡逑所有的ＤＡＣ结构域蛋白都含有保守的氨基酸序列，相邻基因与各类ＤＡＣ逡逑的协同作用
ＧｄｐＰ是一个挂膜蛋白，为了进一步了解跨膜区位置（便于后继改造），逡逑我们用跨膜蛋白的预测网站（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ－２．０）对该逡逑蛋白进行了跨膜区域预测，其结果如图２－２所示：我们从预测结果可以看到，该逡逑蛋白的前５４个氨基酸是跨膜区域
我们为／进一步对载体进行构建，还使用ＤＮＡｓｔａｒ中的Ｐｒｏｔｅａｎ对ＧｄｐＰ疏水性进行了分析，其结果如图２－３所示，最下边一行为疏水性的分析，域在上边的位置是亲水性区域，黄色区域在下边的是疏水性区域，分析我发现该蛋白的Ｎ端具有较强的亲水性，所以在载体构建的过程中，尽量Ｎ端Ｔａｇ标签的载体。逡逑１邋Ｔ邋－邋｜邋■邋Ｉ邋＇邋Ｉ邋｜邋■邋，邋，邋邋邋｜邋，邋１邋｜逦！邋■邋Ｉ邋■邋｜逡逑Ｉ邋ｒ邋？－＊邋＊ｃ邋ａ邋＇Ｘ邋ｒ．邋－ｖ邋ｚ邋７ｒ．邋７ｉ邋＇ｆｔ邋ｘａ邋ｋ邋ｔｔ邋ｖ：邋ａ邋0邋＾邋ｍ邋ｖ：邋７．邋ｖ．邋ｎ邋％逦％逡逑＊＾鲁曷１１—１１＿邋？逦？邋—＾暑馨■（■軎？灥邋４ＭＩ邋州如：分逡逑＊１－邋Ｉ邋￣邋x哄巍觥鲥澹樱停湾澹俊鰺8暴１邋灥－．１■
本文编号：2820710
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