复合黏膜免疫佐剂辅佐的重组蛋白NMB0315疫苗免疫效果研究

发布时间：2020-09-21 22:11

　　 [目的]初步探究复合黏膜免疫佐剂(Chi-CpG NP、Chi-C48/80 NP)的理化性质及相关特性,检测其辅佐B群脑膜炎奈瑟菌0315(Neisseria meningitides serogroup B,NMB0315)重组蛋白滴鼻免疫BALB/c小鼠产生的特异性体液免疫和细胞免疫应答水平,特别是黏膜免疫应答水平及其免疫保护效果,为寻找合适的黏膜免疫佐剂、研制高效B群流脑疫苗提供实验依据。[方法]1.用壳聚糖纳米颗粒(Chi NP)分别包裹免疫刺激分子(CpG-ODN或C48/80)合成复合黏膜免疫佐剂(Chi-CpG NP、Chi-C48/80 NP),透射电子显微镜(TEM)观察形态,Zetasizer Nano-ZS测定电势电位及聚合物分散指数(PDI),测定上清液游离的免疫刺激分子含量计算装载率;BCA法测定对重组蛋白NMB0315(r NMB0315)的吸附率;2.制备r NMB0315疫苗:扩大培养含p ET-30a/NMB0315质粒的E.coli BL21重组菌株(本课题组构建保存),诱导表达r NMB0315随后经His亲和层析柱纯化,纯化的r NMB0315用Western Blot鉴定。3.检测r NMB0315疫苗的免疫活性及免疫保护效果:将所制备的Chi-CpG NP、Chi-C48/80 NP分别与纯化的r NMB0315以一定比例充分混合、吸附,滴鼻免疫雌性BALB/c小鼠,收集小鼠鼻腔灌洗液、阴道分泌物和血清,采用间接ELISA法测定特异性s Ig A、Ig G及其亚类。免疫第42天,CCK-8法测定小鼠脾淋巴细胞增殖的刺激指数(SI),ELISA法测定小鼠脾淋巴细胞培养上清液中IL-17A、IL-4和IFN-γ含量。按一定比例将免疫血清、人补体、及生长至对数期的MC58菌液混合,检测免疫血清体外杀菌活性。以致死剂量的MC58菌液攻击实验小鼠,观察记录复合黏膜免疫佐剂辅佐的r NMB0315疫苗对实验小鼠的免疫保护效果。[结果]1.TEM观察Chi-CpG NP和Chi-C48/80 NP呈球形,大小较均一,粒径分布在150~200 nm之间;zeta电位值分别为11.25±0.052mv和19.54±0.069 mv,PDI分别为0.286和0.415;Chi-C48/80 NP对r NMB0315的吸附率为85.5%,强于Chi-CpG NP(71.2%)。2.Chi-CpG NP和Chi-C48/80 NP分别与r NMB0315联用能诱导高水平的体液免疫应答。r NMB0315+Chi-CpG NP组和r NMB0315+Chi-C48/80 NP组特异性Ig G、Ig G1、Ig G2a抗体效价峰值分别为1:150000、1:40000、1:50000;1:170000、1:60000和1:50000;鼻腔灌洗液和阴道分泌物特异性s Ig A抗体效价峰值分别为1:40000、1:40000;1:60000、1:40000;小鼠脾淋巴细胞培养上清IL-4含量分别为176.48±19.79pg/m L、185.16±21.06pg/m L。上述与体液免疫相关的指标均显著高于r NMB0315单独免疫组。免疫第42天,血清特异性Ig G2a/Ig G1比值趋向于1。3.r NMB0315+Chi-CpG NP组和r NMB0315+Chi-C48/80 NP组能诱导高水平的细胞免疫应答。免疫小鼠脾淋巴细胞增殖刺激指数SI分别为1.569±0.153、1.799±0.188;IFN-γ的含量分别为126.09±11.77 pg/m L、182.48±16.25 pg/m L,均明显高于r NMB0315组(P0.001);其中r NMB0315+Chi-CpG NP组诱导的细胞免疫应答强于r NMB0315+Chi-C48/80 NP组(P0.05,P0.01)。4.Chi-CpG NP和Chi-C48/80 NP辅佐的r NMB0315均能诱导Th17型免疫反应,促进IL-17A的分泌。5.免疫第42天,r NMB0315组、r NMB0315+Chi-CpG NP组和r NMB0315+Chi-C48/80NP组小鼠免疫血清在补体介导下的体外杀菌抗体滴度分别为1:2、1:4和1:8;致死剂量B群脑膜炎奈瑟菌MC58攻击后免疫小鼠的存活率分别为60%、75%和85%。[结论]1.成功制备了复合黏膜免疫佐剂Chi-CpG NP和Chi-C48/80 NP。2.Chi-CpG NP、Chi-C48/80 NP辅佐的r NMB0315疫苗经鼻免疫小鼠能诱导产生较强的体液免疫和细胞免疫,尤其是较高水平的黏膜免疫应答。3.r NMB0315+Chi-C48/80 NP组免疫血清体外杀菌活性及对实验小鼠的免疫保护作用高于r NMB0315+Chi-CpG NP组。
【学位单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R392
【部分图文】：

凝胶,亲和层析,实验结果,相对分子质量

第 4 章实验结果第 4 章实验结果的表达、纯化及 Western blot 鉴定5 的表达、纯化表达 6h, 表达的蛋白采用 Ni-NTA 亲和层析GE 分析，得到与 rNMB0315 相对分子质量。

重组蛋白,特性检测,佐剂

4.2 Western-blot 鉴定重组蛋白 rNMB04.2 Analysis of rNMB0315 protein by WesteM: protein Marker； 1,2: the purified rNP 、Chi-C48/80 NP 特性检测、Chi-C48/80 NP 的形态Chi-C48/80 NP 经 TEM 观察，如图 4大小较均一，分散均匀，未出现明、Chi-C48/80 NP 黏膜免疫佐剂是稳

吸附率,系统免疫,激发机,抗体应答

4 Chi-CpG NP 、Chi-C48/80 NP 对 rNMB0315 的吸附率ading efficiency of Chi-CpG NP and Chi-C48/80 NP to rN NP 、Chi-C48/80 NP 辅佐的 rNMB0315 疫系统免疫应答水平后血清特异性 IgG 水平检测抗体应答水平，发现血清 IgG 水平随着免疫次高，免疫后 14 天 rNMB0315+Chi-CpG NP 组组（P＜0.05），rNMB0315+ Chi-C48/80 NP 组/80 组（P＜0.05），表明复合佐剂能够迅速激发机315+Chi-CpG NP、rNMB0315+ Chi-C48/80 NP 组 I

【参考文献】