电针委中穴在模型大鼠腰多裂肌损伤修复过程中对自噬相关蛋白Beclin1, p62的影响

发布时间：2020-09-21 15:33

【摘要】：研究背景:在腰部,多裂肌位于竖脊肌的深部,主要起稳定腰椎,保证各个腰椎的紧密连接、并精细分配腰椎所受压力的作用。一旦腰多裂肌受到损伤影响多裂肌正常功能的发挥,就会破坏腰椎正常稳定状态引发腰痛。据调查显示:西方国家有2/3的人群受腰痛影响,因腰痛引起的残疾更为位居世界前位,给千千万家庭带来了痛苦。因此,促进损伤多裂肌的修复和功能重建对于治疗急慢性腰痛,提高腰痛患者生活质量尤为重要,也将为针刺治疗腰痛提供更有力的证据。针刺委中穴对腰痛的独特治疗作用已得到针灸临床的一致认可。然而综合分析以往文献发现,在委中促进骨骼肌损伤的再生与修复方面尚未有较好的研究成果。肌肉损伤后,肌卫星细胞的激活是肌肉修复的前提,它的激活需要自体吞噬系统(自噬)的参与,因此,自噬水平的高低直接影响到修复的质量和时间。本研究拟从组织形态学对对多裂肌进行观察;另一方面通过观察电针“委中”穴对自噬相关蛋白Beclin1、p62表达的影响,进一步探索电针委中穴、自噬以及多裂肌损伤修复三者之间的关系。研究目的:1.从组织形态学方面观察布比卡因所致的腰多裂肌损伤大鼠模型的恢复情况,并对比布比卡因所致的腰多裂肌损伤大鼠模型自噬通路被阻断时的恢复情况。2.从Beclin1、p62的定量表达方面观察电针“委中”穴对大鼠腰多裂肌损伤后自噬对修复过程的影响。研究方法:实验一:大鼠腰多裂肌损伤模型观察。体重为290-320g的54只健康SPF级雄性大鼠,随机分笼饲养,适应性喂养7天,随机分为空白组、实验组和实验抑制剂组,每组18只大鼠,每组大鼠又随机分为1天、3天、7天三个小组,每个小组6只大鼠。实验组大鼠,10%水合氯醛以每千克350mg的量进行腹腔注射麻醉,选择背部第4/5腰椎脊柱水平两旁的4个点,使用一次性4号针头注射器抽取0.5%布比卡因肌肉注射400 μ L(每个点100μL),针头紧贴棘突旁进入肌肉,直到接触关节突和乳突所在的骨面回抽套管1mm无血,说明此时已到达多裂肌,各点分别注射布比卡因100 μL,每个点注射时间必须大于3秒,以保证药物的充分吸收。单次注射布比卡因完成造模。造模后,实验组给予生理盐水于损伤局部皮下注射(0.1mg/kg),1次/d;实验抑制剂组行LY294002损伤局部皮下注射(0.1mg/kg),1次/d。每组分别在造模后的第1d、3d、7d同步取材各6只,并在光学显微镜下观察铁苏木素染色、Masson染色、HE染色对三组大鼠腰部多裂肌形态学表达情况。实验二:体质量280～310g72只SPF级健康成年雄性SD大鼠,随机分笼饲养,在适应性喂养7天之后,所有大鼠按体质量分层,采用随机数字表法分为空白组、模型组、电针委中组,每组24只,这三组大鼠再随机分为1天、3天、7天三个小组,每个小组8只大鼠。采用10%水合氯醛以每千克350mg的使用量进行腹腔注射麻醉,背部备皮,操作全程保持无菌。选择脊柱L4、L5水平两旁的4个点,使用一次性4号针头注射器抽取0.5%布比卡因肌肉注射400 μL(每个点100 μL),针头紧贴棘突旁进入肌肉,直到接触关节突和乳突所在的骨面回抽套管1mm无血,说明此时针头已到达多裂肌,各点分别注射布比卡因100 μL,时间必须大于3秒,以利于药物的充分吸收。空白组不做任何处理。造模完成后,电针委中组进行每日一次的电针委中治疗。然后在光学显微镜观察HE染色后各组大鼠损伤多裂肌在第1天、3天、7天的组织形态学变化,采用免疫组化法和Western Blotting法观察多裂肌中Beclin1,p62表达含量的动态变化。以电针委中穴、自噬、多裂肌损伤修复为着眼点进一步探索电针委中穴促进多裂肌损伤修复的作用机理。研究结果:1.造模后多裂肌恢复的不同时间点通过3种染色方法(HE染色、Masson染色、铁苏木素染色)发现多裂肌组织形态学改变显著,除了造模后的第1天两组多裂肌在组织形态学上的表现相似,其余第3、7天实验组骨骼肌恢复情况均比实验抑制剂组好。2.电针“委中”穴对布比卡因所致大鼠腰多裂肌损伤后不同阶段自噬相关蛋白Beclin1、p62表达的影响。1天、3天、7天模型组的Beclin1表达含量均高于空白组(P0.01),3天、7天电针委中组的Beclin1表达含量高于模型组(P0.05);3天、7天模型组p62表达含量低于空白组(P0.05);1天、3天、7天电针委中组p62表达低于模型组(P0.05)。研究结论:1.通过三种染色方法观察受损多裂肌,发现自噬信号通路抑制剂LY294002可特异性阻止自噬的发生,可使骨骼肌损伤后的修复进程相对延缓。2.电针委中穴可促进自噬蛋白Beclin1的表达上调,提高自噬水平,促进p62蛋白的分解,缩短肌细胞坏死的进程,加速损伤肌纤维的再生,有利于骨骼肌损伤后的修复。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R245;R-332
【图文】：

空白组Ｂｅｃｌｉｎｌ的表达量相对较低，治疗１天后，模型组与电针委中组逡逑大鼠腰多裂肌Ｂｅｃｌｉｎｌ的表达无明显差异（乃０．０５），但电针委中组的表达量有明显上逡逑升；空白组的表达低于电针委中Ｄ组和模型组（Ｋ０．邋０１）；治疗３天后，模型组高于空逡逑白组（Ｋ０．邋０１），电针委中组的表达高于空白组和模型组（Ｋ０．邋０５）；治疗后第７天，逡逑模型组与电针委中组的表达均高于空白组（Ｋ０．邋０１），电针委中组Ｂｅｃｌｉｎｌ表达量高于逡逑模型组（Ｋ０．邋０５）。逡逑表１各组大鼠不同时段多裂肌Ｂｅｃｌｉｎｌ表达ＭＯＤ值比较（ｘｉ５）逡逑组别逦ｎ逦１天逦３天逦７天逡逑空白组逦８逦０．５２＋０．邋１０逦０．邋５０±０，邋１８逦０．５０±０，邋１７逡逑模型组逦８逦１．０８±０．２０ａ逦１．邋１５±０．２４ｂ逦０．８５±０．邋１９ｂ逡逑电针委中组逦８逦１．２６±０．３８ｂ逦１．４０±０．邋１７ｂｃ逦１．０８±０．０８ｂｃ逡逑注：与空白组比较，ａＫ０．０５，邋ｂＫ０．邋０１；与模型组比较，７＜０．０５逡逑

空白组ｐ６２表达含量较高，治疗１天后，大鼠腰多裂肌ｐ６２的表达模型逡逑组与空白组无明显差异（？＞０．０５），但模型组的表达量己有下降趋势，电针委中组的表逡逑达量明显低于空白组和模型组（Ｐ＜0．0５）；治疗３天、７天后，模型组明显低于空白组逡逑（Ｐ＜０．０５），电针委中组的表达量低于模型组（Ｐ＜０．０１）。各组大鼠不同时段腰多裂肌逡逑ｐ６２表达免疫组化染色结果见图３。逡逑表２各组大鼠不同时段多裂肌Ｐ６２表达ＭＯＤ值比较Ｇｉｓ）逡逑组别逦ｎ逦１天逦３天逦７天逡逑空白组逦８逦１．２６±０．３０逦１．２９±０．邋１７逦０．８９±０．邋１１逡逑模型组逦８逦１．邋１３±０，邋１８逦１．０１±０．２８１＇逦０．７２±０．２３ａ逡逑电针委中组逦８逦０．邋７１±０．２４＾邋０．６５±０．邋１６ｂｔ邋０．４７＋０．０９ｂｄ逡逑注：与空白组比较，ＷＯ．邋０５，邋ｂＫ０．邋０１；与模型组比较，Ｗ０．０１，邋ｄ／ｍ0５。逡逑

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本文编号：2823665