MERS-CoV感染hDPP4转基因小鼠模型的建立及免疫病理损伤机制研究

发布时间：2020-09-23 06:34

　　中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)是一种新发的高致病性冠状病毒,其致死率高达35%,而2003年流行的SARS冠状病毒致死率仅为10%。MERS-CoV受体为人DPP4蛋白,由于不同种属DPP4分子的差异,导致该病毒不能感染常见的小鼠、仓鼠等动物,缺乏合适实验动物模型。另外,目前仍然缺乏临床患者病理损伤相关的研究,对该病毒感染导致的组织病理损伤特征及致病机制知之甚少。已有的有限的研究资料显示免疫介导的病理损伤在MERS-CoV致病中可能发挥着重要作用。我们的前期研究结果表明,高致病禽流感H5N1、H7N9等病毒感染所致补体异常会导致肺损伤。这提示我们补体异常可能在MERS-CoV致病过程中有同样的作用。本研究旨在构建一种能感染MERS-CoV的转基因小鼠模型,并进行MERS-CoV感染致病机制研究。1.MERS-CoV感染hDPP4转基因小鼠模型的建立。首先我们对hDPP4基因进行了密码子优化,人工合成该基因后构建入真核表达载体,将载体转染不表达DPP4蛋白的COS-7细胞,利用免疫荧光技术验证了载体在细胞水平的表达和表达的蛋白的生物学功能。将验证的载体线性化后显微注射入小鼠受精卵,移植假孕鼠获得转基因首建鼠,将首建鼠与野生型小鼠杂交,筛选获得转基因纯合小鼠并扩大繁育用于实验。在生物安全三级实验室,用MERS-CoV滴鼻感染hDPP4转基因小鼠,结果显示感染后第4天小鼠开始出活动力下降和显著的体重减轻,至感染第10天全部死亡。说明构建的转基因小鼠能感染MERS-CoV,并且感染可致小鼠死亡。2.hDPP4转基因小鼠MERS-CoV感染特征研究。在生物安全三级实验室,用MERS-CoV感染hDPP4转基因小鼠,对照组用DMEM模拟感染,观察小鼠生存状态和存活率,并记录小鼠体重变化。在特定时间点取小鼠肺、脾、肾、脑、肝和血清,组织病理学检查发现五种组织都有不同程度的病理学损伤;免疫组化、实时定量PCR等方法检测发现在肺、肾、脑中有大量病毒抗原的表达与复制;免疫组化还检测到肺、脾、肾、肝中大量炎性细胞浸润,Luminex液相芯片技术检测到血清IFN-γ、IP-10、IL-17等细胞因子显著升高。3.补体在MERS-CoV感染所致多器官损伤中的机制研究。首先用MERS-CoV感染hDPP4转基因小鼠,免疫组化和ELISA等方法检测小鼠补体的激活。结果显示,在小鼠肺组织中有大量C5b-9的沉积与C5aR的表达,血清中C5a也大量升高,证明MERS-CoV感染可引起补体大量激活。为探索补体在MERS-CoV所致组织损伤中的作用,在感染前尾静脉注射抗小鼠C5aR抗体,阻断C5a与C5aR的结合。结果显示,阻断C5a-C5aR补体通路后,可以减轻肺组织与全身炎症反应;减少肺组织中病毒复制;减轻肺组织、脾组织损伤;促进脾细胞再生,减少脾细胞凋亡。本研究通过转基因技术成功获得了hDPP4转基因小鼠,并利用该小鼠建立了MERS-CoV致死性感染模型。该模型能较好的模拟临床病人感染状态,将在MERS-CoV致病机制与药物疫苗评价中发挥重要作用。MERS-CoV感染hDPP4转基因小鼠后会引起宿主补体过度激活和异常的免疫反应,用抗C5aR抗体阻断C5a-C5aR补体途径后能显著降低异常的免疫反应,有效减轻过度免疫反应造成的免疫组织病理损伤。本研究揭示了MERS-CoV感染所致组织损伤新机制,为MERS-CoV感染的防治提供了一条新的免疫干预治疗策略。
【学位单位】：军事科学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R511;R-332
【部分图文】：

重组质粒,质粒,小鼠基因组,条带

军事科学院博士学位论文别为 2301bp 的 hDPP4 目的基因条带和 4821bp 的 pCAGGS 载体，结果与（图 1.2）；用特异性引物 DP42-F/R 对不同浓度的 pCAGGS-hDPP4 重组PCR 扩增，5×10-4ng~5ng 范围内的质粒均能扩增出 439bp 的目的条带，而L/6 小鼠基因组 DNA 没有扩增出条带（图 1.3），说明 pCAGGS-hDPP4 重确，而且转入小鼠基因组后，在后续的转基因小鼠 PCR 鉴定中不会产生条带。胞免疫荧光检测人 DPP4 蛋白的表达鉴定正确的pCAGGS-hDPP4重组质粒转染不表达DPP4蛋白的COS-7细ITC 标记的大鼠抗人 DPP4 抗体，通过细胞免疫荧光技术检测细胞内人 DP表达。结果如图 1.4 所示，与转染 pCAGGS 空质粒的细胞相比，转GS-hDPP4 重组质粒的 COS-7 细胞呈现很强的绿色荧光，说GS-hDPP4 重组质粒能在真核细胞中表达人 DPP4 分子。A B

转基因,PCR鉴定,显微注射,仔鼠

图 1.5：免疫荧光检测 DPP4 分子与 MERS-RBD 的结合A：pCAGGS 质粒；B：pCAGGS-hDPP4 重组质粒2.4 hDPP4 转基因载体的显微注射及 hDPP4 转基因首建鼠的鉴定在 hDPP4 转基因小鼠制备过程中，显微注射后共获得 500 枚成活的受精卵分别移植到 25 只假孕母鼠体内，其中 7 只怀孕，怀孕率为 28%；出生仔鼠 39 只，产仔率为 7.80%。以 PCR 方法鉴定仔鼠的鼠尾 DNA，共获得 7 只 hDPP4 转基因阳性鼠，阳性率为 17.9%。图 1.6 所示为 hDPP4 转基因首建鼠的 PCR 鉴定结果。A B

重组质粒,质粒,分子,转染

转染 COS-7 细胞后，利用 MERS-RBD-Fc 蛋白和 DyLight 594 标记的山羊抗人 IgG抗体，通过细胞免疫荧光技术检测人 DPP4 蛋白与病毒受体结合区（RBD）的结合功能。结果如图1.5所示，与转染pCAGGS空质粒的细胞相比，转染pCAGGS-hDPP4重组质粒的 COS-7 细胞呈现很强的红色荧光，说明表达的人 DPP4 分子有和MERS-CoV 受体结合区（RBD）结合的功能。A B

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