血小板生成素对化学性缺氧诱导的内皮细胞损伤的保护作用研究

发布时间：2020-09-25 22:53

　　研究背景:血小板生成素(thrombopoietin,TPO)是一种调节巨核细胞生长的特异性细胞因子,研究发现其不仅在造血系统有重要作用,在造血系统外也有作用,例如TPO可以作用于内皮细胞、神经细胞、心肌细胞和卵巢等组织。相关研究发现,血小板生成素具有潜在的细胞保护作用,TP0对于药物和缺血引起的心肌损伤具有保护作用;TP0对于新生大鼠缺血缺氧性脑损伤的神经保护作用。所以,我们提出TPO对于内皮细胞也具有保护作用,并探索其相关作用机制。相关研究己经证实TPO与其受体(c-Mpl)结合后可以作用于相关的信号转导通路来影响细胞的成熟、增殖以及凋亡。故我们推测TPO通过其受体作用于相关信号通路发挥保护作用。因此本实验主要研究TPO对于缺血缺氧引起的内皮细胞细胞损伤是否具有保护作用,并进一步探索保护作用的机制。研究方法:一、TPO对CoCl2作用下内皮细胞凋亡的影响l.CCK-8法探索TPO保护缺氧损伤的内皮细胞的最佳作用条件;2.流式细胞术检测TPO对缺氧所致内皮细胞凋亡率、凋亡蛋白酶Caspase-3的表达以及线粒体膜电位的变化。二、TPO抑制CoCl2诱导的内皮细胞凋亡的分子机制1.采用Q-PCR,Western Blot方法检测内皮细胞上TPO受体(c-Mpl)mRNA或蛋白的表达;2.使用Western Blot的方法检测TPO对PI3K/AKT通路磷酸化水平的影响。研究结果:一、TPO对CoCl2作用下内皮细胞凋亡的影响1.CCK-8结果示:使用不同浓度的CoCl2处理HUVEC细胞24h后,细胞存活率逐渐下降;选用低于IC50值的CoCl2浓度800μmol/L处理HUVEC细胞作为细胞缺氧模型。在CoCl2处理HUVEC细胞前,使用不同浓度的TPO预处理48h,细胞活性得到明显改善,TPO浓度为100μg/L时细胞活性为(72.10 ±5.11)%,比CoCl2组明显升高(45.39±9.22)%,差异有统计学意义(P= 0.025),选用此浓度建立细胞保护模型。2.检测内皮细胞凋亡率结果显示:与Control组相比较(6.33 ± 0.80)%,CoCl2组的凋亡率明显升高(19.54±1.40)%,P0.001;而TPO+CoCl2组的细胞凋亡率较前者明显下降(12.19 ±0.84)%,P0.001;这提示TPO对HUVEC损伤有保护作用。3.各组细胞凋亡蛋白酶Caspase-3的表达结果显示:CoCl2组表达凋亡蛋白酶Caspase-3 的细胞比例为(43.62±1.83)%,显著高于Control组(6.80±0.30)%,P0.001;而TPO能显著降低由CoCl2导致的Caspase-3表达升高(28.83 ±3.00)%,P = 0.039。4.线粒体膜电位变化的结果显示:CoCl2组细胞线粒体膜电位明显低于Control 组,(41.09±4.52)%VS(5.91 ±0.54)%,P0.001;而 TPO 组 HUVEC细胞的线粒体膜电位较CoCl2组升高,(14.52 ±2.47)%,P= 0.038。二、TPO抑制CoCl2诱导的内皮细胞凋亡的分子机制1.采用Q-PCR,Western Blot方法都可以检测到内皮细胞TPO受体mRNA或蛋白的表达;2.TPO还可以刺激内皮细胞PI3K/AKT通路的活化,对细胞凋亡起保护作用研究结论:1.TPO对化学性缺氧所致的内皮细胞凋亡起保护作用;2.其机制可能是通过活化PI3K/AKT通路,从而减少细胞凋亡蛋白酶Caspase-3的活化表达和稳定线粒体膜电位来发挥细胞保护作用。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R363
【部分图文】：

信号通路,生物学效应,凋亡抑制因子,免疫调节

图１邋ＴＰＯ发挥生物学效应的信号通路图［５７］逡逑Ｆｉｇ邋１邋Ｔｈｅ邋ｃｅｌｌ邋ｓｉｇｎａｌ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｏｆ邋ＴＰＯ［５１逡逑，ＴＰＯ还参与机体创伤后的应激修复、免疫调节等多种作用。ＰＯ能被多种肿瘤细胞分泌并成为凋亡抑制因子，可能因此促

细胞的,浓度,内皮细胞损伤

使得细胞的存活率逐渐下降（ｒ＝－０．９９７），当８００邋ｐｍｏｌ／Ｌ的ＣｏＣｌ２作用２４ｈ时，细逡逑胞的抑制率可达５０％以上，为理想的造模条件。综合考虑选用８００邋ｐｍｏｌ／Ｌ的逡逑ＣｏＣｌ２作用２４邋ｈ作为最佳造模条件（图２）。逡逑１２０－．逡逑１００－逡逑＾邋８0逡逑＝６０－逡逑｜逦４。－逡逑＝邋２０－邋？逡逑０＞逡逑Ｏ邋0Ｈ逦１逦１逦１逦１逦１逦１逡逑０逦０逦２００逦４００逦６００逦８００逦１０００逡逑ＣｏＣＩ２邋浓度｛ｊｍｏｌ／Ｌ｝逡逑图２不同浓度的ＣｏＣｌ２对ＨＵＶＥＣ细胞的影响，当ＣｏＣｌ２的浓度为８００邋ｐｍｏｌ／Ｌ细胞的抑制逡逑率达５０％以上（ｎ邋＝邋３，ｒ＝－０．９９７）。逡逑Ｆｉｇ邋２邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋Ｃ０ＣＩ２邋ｏｎ邋ＨＵＶＥＣ邋ｃｅｌｌｓ．邋Ｔｈｅ邋ａｓｓａｙ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｓ邋ｔｈａｔ逡逑ｔｈｅ邋ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ邋ｒａｔｅ邋ｗａｓ邋ｍｏｒｅ邋ｔｈａｎ邋５０％邋ｗｈｅｎ邋Ｃ０ＣＩ２邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｉｓ邋８００邋｜ｉｍｏｌ／Ｌ（邋ｎ邋＝邋３，逡逑ｒ＝－０．９９７）．逡逑３．２ＴＰＯ对ＨＵＶＥＣ细胞凋亡的影响逡逑ＣＣＫ－８法探索ＴＰＯ保护缺氧所致内皮细胞损伤的最佳条件，应用不同浓度逡逑的邋ＴＰＯ邋（１０、５０、１００、２００、５００邋ｐｇ／Ｌ）预处理邋ＨＵＶＥＣ邋细胞邋４８ｈ邋后，ＴＰＯ邋１０－５０逡逑ｐｇ／Ｌ的浓度范围内，呈浓度依赖性的对抗ＣｏＣｌ２诱导的细胞活性降低作用，随逡逑着ＴＰＯ的浓度升高到一定程度

细胞损伤,细胞间隙,凋亡细胞

积细胞数量不如正常组致密，细胞间隙变大，细胞数目减少，凋亡细胞明显增逡逑多；ＴＰＯ保护组的细胞皱缩变圆，细胞间隙变大，但细胞之间仍然存在联系，逡逑凋亡细胞相对较少（图４）。逡逑１５逡逑

【参考文献】