ZHX1在D-半乳糖诱导的耳蜗毛细胞株拟老化模型中的作用及机制研究

发布时间：2020-10-09 03:57

　　 【目的】观察ZHX1在D-半乳糖诱导的耳蜗毛细胞株OC-1拟老化模型中的表达情况,初步探讨ZHX1在老年性聋发病过程中可能的作用及机制。【方法】(1)耳蜗毛细胞株用不同浓度梯度的D-半乳糖作用48h,CCK-8检测细胞活性,筛选出15mg/ml的浓度来建立拟老化模型。(2)按照不同的处理方式进行以下分组:1)C组:对照组,用普通培养基培养48h,不做特殊处理;2)D组:D-半乳糖组,用浓度为15mg/ml的D-半乳糖培养基培养48h;3)NC组:转染阴性对照组,与目的基因序列无同源性,转染6h后,改用15mg/ml D-半乳糖培养基继续培养48h;4)Si组:ZHX1沉默组,含目的基因ZHX1的si RNA,转染6h后,改用15mg/ml D-半乳糖培养基继续培养48h。(3)分别使用光学显微镜和透射电镜观察细胞的形态和超微结构;RT-PCR检测线粒体DNA缺失率(CD);Annexin V-PI匹配使用,检测细胞凋亡率;DCFH-DA探针作标记,检测细胞内活性氧含量;JC-1探针法检测细胞线粒体膜电位,并用共聚焦显微镜进行观察;酶标仪比色法检测GSH、MDA、ATP的含量,及SOD、CAT的活力;RT-PCR检测P16、P21、ZHX1、TWIST1、Bcl-2、NRF-1的m RNA表达水平;Western blot检测ZHX1、Bcl-2、Bax、caspase-3、NRF-1的蛋白表达水平。【结果】(1)透射电镜的结果显示,C组的细胞外形规则,胞膜完整,胞质均匀致密,含有丰富的细胞器,线粒体和内质网的结构完整、清晰;D组的细胞外形欠规则,有较为明显的内陷,核膜完整性被破坏,出现核碎片,细胞质疏松紊乱,细胞器结构变形,线粒体嵴减少、肿胀,甚至出现空泡。(2)D组的CD缺失率较C组升高,P16和P21的m RNA表达水平上调。(3)D组的细胞活性氧含量较C组升高。(4)D组和NC组的细胞凋亡率较C组升高,Si组较NC组升高。(5)D组和NC组的线粒体膜电位水平较C组降低,Si组较NC组降低。(6)D组和NC组的SOD、CAT活力及GSH、ATP含量均较C组降低,MDA含量升高;Si组与NC组比较,SOD、CAT活力和GSH、ATP含量降低,MDA含量升高。(7)RT-PCR检测m RNA表达水平,D组和NC组的ZHX1、TWIST1、Bcl-2和NRF-1的表达水平均较C组降低,Si组的ZHX1、Bcl-2和NRF-1的表达水平较NC组降低,TWIST1的表达水平则无明显区别。(8)Western blot检测蛋白表达水平,D组和NC组的ZHX1、NRF-1的表达水平较C组降低,Bcl-2/Bax比值降低,活性caspase-3的表达水平升高,Si组与NC组比较,ZHX1、NRF-1的表达水平降低,Bcl-2/Bax比值降低,活性caspase-3的表达水平升高。【结论】(1)在一定时间内给予耳蜗毛细胞株高浓度的D-半乳糖处理,可使细胞内活性氧含量增多,CD缺失率升高,P16和P21表达水平上调,细胞超微结构出现退行性改变,说明我们成功建立体外耳蜗毛细胞株的拟老化模型。(2)用si RNA可以有效干扰ZHX1的表达,影响细胞凋亡和氧化应激的进程,ZHX1可能在耳蜗毛细胞株的衰老过程中起保护作用。(3)ZHX1可能通过调节Bcl-2和NRF-1的表达水平发挥作用。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R-332;R764.436
【部分图文】：

1.耳蜗毛细胞株的形态观察（×40） （×200）图1. 用普通培养基培养48h后，在光镜下观察耳蜗毛细胞株的形态。2.细胞活性检测图2. 用不同浓度梯度的D-半乳糖处理细胞48h后检测细胞活性，发现浓度大于15mg/ml时，耳蜗毛细胞株的活性明显降低，决定采用15mg/ml作为处理条件，**P＜0.01，***P＜0.001。

图1. 用普通培养基培养48h后，在光镜下观察耳蜗毛细胞株的形态。2.细胞活性检测图2. 用不同浓度梯度的D-半乳糖处理细胞48h后检测细胞活性，发现浓度大于15mg/ml时，耳蜗毛细胞株的活性明显降低，决定采用15mg/ml作为处理条件，**P＜0.01，***P＜0.001。

组：对照组；D组：D-半乳糖组。D-半乳糖作用48h后，D组的CD升高，**P＜0.01。耳蜗毛细胞株的超微结构镜下观察耳蜗毛细胞株的超微结构，如图所示，对照组的细胞形态整，胞质均匀致密，含有丰富的细胞器，线粒体和内质网的结构完-半乳糖组的细胞外形欠规则，有较为明显的内陷，核膜完整性被破片，细胞质疏松紊乱，细胞器结构变形，线粒体嵴减少、肿胀，甚

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 向明亮,穆美云,迟放鲁,李克勇;正常小鸡耳蜗毛细胞神经支配的发育与听功能的关系[J];上海医科大学学报;2000年05期

2 陶昆耀;;耳蜗毛细胞丧失与年龄关系的比较研究[J];国外医学.耳鼻咽喉科学分册;1987年06期

3 王爱梅;许涛;刘双月;牟华;;α-硫辛酸对卡那霉素致离体小鼠耳蜗毛细胞损伤的防护作用[J];中国老年学杂志;2013年19期

4 李厚勇;;耳蜗毛细胞再生的研究现况[J];中国眼耳鼻喉科杂志;2000年05期

5 李婷钰;王苹;杜波;杜宝东;;卡那霉素对离体培养大鼠耳蜗毛细胞损害的实验研究[J];中国老年学杂志;2010年01期

6 刘芳芳;王爱梅;许涛;林宇涵;;顺铂对离体培养小鼠耳蜗毛细胞的损伤及凋亡作用[J];南昌大学学报(医学版);2010年08期

7 宣伟军,丁大连;小鼠耳蜗毛细胞体外培养研究方法[J];中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志;2005年03期

8 侯秋来,丁大连,蒋海燕,Richard J.Salvi,尹绍文;庆大霉素对小鼠耳蜗毛细胞损害的离体培养试验模型[J];中华耳科学杂志;2005年03期

9 张勤修,迟放鲁,曹恒明,赵剑星,顾全保;耳蜗毛细胞分离方法的改良[J];上海医科大学学报;1998年05期

10 丁晨茹;迟放鲁;;哺乳动物耳蜗毛细胞再生的研究现状[J];中国眼耳鼻喉科杂志;2016年01期

相关会议论文 前10条

1 郑贵亮;周义德;郑宏良;胡博华;;细胞内氧化还原作用在脉冲声诱发耳蜗毛细胞坏死中的作用[A];2010全国耳鼻咽喉头颈外科中青年学术会议论文汇编[C];2010年

2 徐娅苹;管明;;大鼠骨髓间充质干细胞分化为耳蜗毛细胞前体的研究[A];2006年浙江省耳鼻咽喉科学术会议论文汇编[C];2006年

3 杨卫平;胡博华;Donald Henderson;;苯乙烯致聋的耳蜗毛细胞死亡方式[A];中华医学会第十次全国耳鼻咽喉-头颈外科学术会议论文汇编（上）[C];2007年

4 翟所强;张媛;汪学勇;宋巍;郑贵亮;朱玉华;于宁;郭维维;胡吟燕;孙建和;高维强;;哺乳动物耳蜗毛细胞再生实验研究[A];中华医学会第十次全国耳鼻咽喉-头颈外科学术会议论文汇编（上）[C];2007年

5 李永奇;丁大连;李鹏;蒋海燕;Richard Salvi;;小鼠顺铂耳蜗毛细胞损伤模型[A];全国耳鼻咽喉头颈外科中青年学术会议论文汇编[C];2012年

6 倪月秋;汤浩;;川芎嗪促进豚鼠庆大霉素中毒耳蜗毛细胞再生修复作用[A];中国生理学会第21届全国代表大会暨学术会议论文摘要汇编[C];2002年

7 马重兵;韩雅迪;严兴科;邢家铭;盛雪燕;朱田田;;针刺对噪音性耳聋模型大鼠耳蜗毛细胞形态学的影响[A];第三届全国穴位埋线疗法经验交流会暨甘肃省针灸学会2015年度学术年会暨中国针灸学会穴位埋线专业委员会申报筹备工作协调会、新世纪全国高等中医药院校创新教材《穴位埋线疗法》评议会暨第十三届全国穴位埋线技术培训班针灸推拿传统与创新手法培训班论文集[C];2015年

8 付平;秦立新;;针刺治疗对听力损害耳蜗毛细胞超微结构的影响[A];2011中国针灸学会年会论文集（摘要）[C];2011年

9 李胜利;朱宏亮;刘全征;王玮;刘平艳;史士合;李德;王福田;;纯中药制剂复聪汤对感音性聋耳蜗毛细胞修复再生的实验研究[A];2012年“中华中医药学会耳鼻喉科分会第18届学术交流会暨世界中联耳鼻喉口腔科专业委员会第4届学术年会”中西医结合耳鸣耳聋新进展学习班论文集[C];2012年

10 刘强和;罗香林;耿宛平;陈晨;雷迅;刘芳贤;王雪梅;;快速老化小鼠听功能和耳蜗毛细胞的增龄性变化[A];中华医学会第十次全国耳鼻咽喉-头颈外科学术会议论文汇编（下）[C];2007年

相关重要报纸文章 前4条

1 本报记者 张佳星;想当“听风者”？得由耳蜗毛细胞说了算[N];科技日报;2018年

2 记者 孙国根;调控可使耳蜗毛细胞再生[N];健康报;2015年

3 忠霞;耳蜗毛细胞espin蛋白变异导致耳聋[N];医药经济报;2007年

4 孙国根;“调控”可使耳蜗毛细胞再生和听觉功能恢复[N];中国医药报;2015年

相关博士学位论文 前10条

1 宋永栋;链霉素损伤耳蜗毛细胞的机制研究[D];山东大学;2018年

2 贺祖宏;FoxG1在小鼠耳蜗毛细胞发育及存活中的机制研究[D];东南大学;2016年

3 毛小波;Nob1在耳蜗毛细胞损伤中的作用研究[D];第四军医大学;2013年

4 刘云;17-DMAG体外诱导HSP70并保护卡那霉素引起的耳蜗毛细胞损伤[D];华中科技大学;2015年

5 韩宇;c-Myc在噪声条件下对耳蜗毛细胞的作用及分子机制[D];第四军医大学;2010年

6 卢娜;音猥因子通过下调pRb的表达水平促进哺乳动物耳蜗毛细胞再生[D];复旦大学;2011年

7 于慧前;逆转H3K9me2保护耳蜗毛细胞的基础研究[D];复旦大学;2012年

8 袁伟;腺病毒介导的A20基因对耳蜗毛细胞保护作用的实验研究[D];第三军医大学;2008年

9 倪月秋;川芎嗪注射液对豚鼠庆大霉素耳毒性保护作用和促进再生修复作用的实验研究[D];中国医科大学;2002年

10 陈请国;质膜钙泵在大鼠耳蜗分布的研究[D];华中科技大学;2011年

相关硕士学位论文 前10条

1 严丹;ZHX1在D-半乳糖诱导的耳蜗毛细胞株拟老化模型中的作用及机制研究[D];华中科技大学;2018年

2 王海霞;小分子物质在耳蜗毛细胞再生中的作用[D];福建医科大学;2012年

3 扶玉珍;萝卜硫素对2型糖尿病小鼠耳蜗毛细胞退行性变的保护作用及机制研究[D];大连医科大学;2015年

4 温丽民;川芎嗪对药物耳毒性耳蜗毛细胞损伤修复的作用机制研究[D];吉林大学;2008年

5 段u&;NOS抑制剂和BDNF对庆大霉素所致离体耳蜗毛细胞损伤的协同防护作用[D];大连医科大学;2004年

6 李秋明;针刺对噪音性耳聋大鼠耳蜗毛细胞VEGF蛋白表达影响的研究[D];长春中医药大学;2010年

7 杨倩倩;NLRX1在C57BL/6小鼠耳蜗毛细胞内的表达及与老年性聋、新霉素致聋相关性研究[D];山东大学;2016年

8 罗香林;快速老化痴呆小鼠听功能、耳蜗毛细胞和螺旋神经元的退行性变化[D];桂林医学院;2010年

9 林垦;BDNF基因转染对庆大霉素耳毒性损伤的保护作用[D];昆明医学院;2008年

10 徐亚平;大鼠嗅上皮神经干细胞体外诱导分化为毛细胞的实验研究[D];第二军医大学;2012年

本文编号：2833192