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Scleraxis慢病毒载体介导hAMSCs向韧带成纤维细胞分化的体外研究

发布时间:2020-10-09 04:32
   目的:探讨Scleraxis慢病毒载体介导hAMSCs后体外向人韧带成纤维细胞分化的潜能与效果。方法:1)取人羊膜经胰酶和胶原酶消化分离hAMSCs,反复贴壁纯化后进行表型鉴定;透射电镜观察细胞内部结构;CCK-8法检测hAMSCs增殖活性;定向分化21d后,分别使用不同染色方法检测hAMSCs向骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞的分化效果。2)取人交叉韧带残端经酶消化法分离培养h LFs,使用倒置相差显微镜观察细胞形态;CCK-8法检测细胞增殖能力,并与hAMSCs相比较;实时荧光定量PCR检测并比较两种细胞I型胶原、腱调蛋白(Tenomodulin),Mohawk及Scleraxis相对表达量。3)构建人Scleraxis基因质粒,经293T细胞对病毒进行收集、滴度测定及MOI测定后转染hAMSCs,RT-PCR和Westen Blot对Scx在hAMSCs中表达验证后,筛选持续分泌Scx的hAMSCs,测定韧带相关基因和蛋白的表达程度,并与Matrigel水凝胶混合后移植裸鼠皮下观察分化效果。结果:1)酶消化法获得大量可稳定增殖的hAMSCs,成长梭形、漩涡状生长贴长;透射电镜显示hAMSCs呈椭圆形,结构清晰,细胞表面有少量微绒毛,染色质分布均匀,胞浆内可见丰富的内质网及排列规则的线粒体;流式表型鉴定示hAMSCs符合MSCs表型。成骨定向诱导后出现多个钙化结节;甲苯胺蓝染色呈示细胞合成多量糖胺聚糖;油红O染色显示胞浆内出现淡黄色脂滴。倒置相差显微镜观察显示,hLFs原代时多以长梭形贴壁生长,细胞核圆形,原代细胞数量较少;传代后呈长梭状并可见漩涡样集落;CCK-8显示hlFs呈“S”形生长曲线,但增殖能力明显低于hAMSCs(P0.05);PCR结果显示,h LFs表达I型胶原、腱调蛋白(Tenomodulin),Mohawk及Scleraxis的mRNA水平均高于hAMSCs(P0.05)。2)酶切产物、菌液PCR检测均显示条带大小为600bp,梯度法转染293T细胞后筛选出滴度为1×10~8TU/μL的病毒原液。以6.5μL病毒原液转染hAMSCs 96h后荧光表达量示转染良好,并以3.5μg/m L浓度的puromycin对细胞进行筛选。RT-PCR显示过表达组Scx表达量在3天、7天均高于空质粒组(P0.05),7天时Scx表达量高于3天(P0.05)。Westen Blot显示转染组Scx蛋白表达量高于空质粒组。3)PCR显示hAMSCs转染Scx后Ⅲ型胶原、赖氨酰氧化酶-1(LOX-1)、纤维连接蛋白(Fibronectin)、腱调蛋白(Tenomodulin,Tnmd)核心蛋白聚糖(Dceorin)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、和细胞连接素(Tenascin-C)的mRNA表达水平于3d、5d和7d时高于空质粒组(P0.05),但仍低于h LFs组(P0.05);而I型胶原荧光5天时强于各组,但7天时与hLFs组表达量无明显差异。Western blot结果显示各组I、Ⅲ型胶原,纤维连接蛋白和细胞连接素的分泌水平随时间的延长而增强,实验组和hLFs组表达量均高于空质粒组(P0.05)。免疫荧光染色发现每组的I型胶原及Fibeonectin表达量随时间增长,h LFs组表达量在3d和7d时分泌量均高于过表达组和空质粒组。过表达组细胞与Matrigel水凝胶混合并移植裸鼠皮下28d后未见明显炎症反应,HE染色示细胞排列更为紧密与规则,形态趋近于正常韧带组织。结论:1)酶消化和贴壁法体外培养的hAMSCs具有MSC的表型和特性。hLFs体外增殖能力hAMSCs较弱但韧带相关基因表达水平较强高,证实Scleraxis为hAMSCs和hLFs的差异性基因。2)构建的Scleraxis基因慢病毒载体在体外转染hAMSCs后能稳定表达且不影响细胞的增殖能力,成功建立了稳转细胞系。3)慢病毒介导Scx转染hAMSCs后能够提高韧带相关基因和蛋白的表达水平,分化形态更趋向成纤维细胞,体内移植后无明显炎症反应。
【学位单位】:遵义医学院
【学位级别】:硕士
【学位年份】:2018
【中图分类】:R329.2
【部分图文】:

间充质干细胞,羊膜,纯度分析


图 1 人羊膜间充质干细胞形态学观察(40×)Fig.1 Morphological characteristic of hAMSCs. (40×)Note: A: Primary cultured hAMSCs(24h); B: P1 generation of hAMSCs;C: P2 generation of hAMSCs; D: P3 generationof hAMSCs2.2 人羊膜间充质干细胞的鉴定及纯度分析P3 代人羊膜间充质干细胞经流式细胞检测结果示:CD44、CD90、CD105、CD73表达阳性;CD34、CD19、CD45、CD11b、HLA-DR 表达阴性(图 2)。

流式细胞仪检测,表型,分子,间充质干细胞


图 2 流式细胞仪检测第 3 代 hAMSCs 表型分子Fig.2 Phenotype molecule expression of the 3rd generation of hAMSCs by flow cytometry.Note: A: CD44; B: CD90; C: CD73; D:CD105; E:CD34+CD19+CD45+CD11b+HLA-DR2.3 染色法观察人羊膜间充质干细胞向成骨、成软骨及成脂细胞分化人羊膜间充质干细胞经成骨分化培养基培养 21d 后,可见细胞逐渐汇合成短棒状,体积变大,逐渐融合成片状并形成钙结节。茜素红染色示钙化结节比较分散,单个结节呈现为橘红色沉淀;成软骨培养 21d 后,观察细胞基质中分泌大量被染为蓝色糖胺聚糖;成脂诱导 21d 后,镜下见细胞立体感明显,并出现脂滴,油红-O 染色显示脂肪沉积(图 3)。

间充质干细胞,成骨,软骨,排列规则


图 3 人羊膜间充质干细胞向成骨、成软骨及成脂细胞分化后 21d 染色结果(100×)Fig.3 The staining results of differentiation of hAMSCs into osteocytes, chondrocytes andlipocytes at 21 (100×)Note: A: osteocytes at day 21 by Alizarin Red staining (100×); B: chondrocytes at day 21 by Toluidine Blue staining(100×); C: lipocytes at day 21 by Oil Red O staining (100×)2.4 透射电镜观察可见 hAMSCs 呈椭圆形,结构清晰,细胞表面有少量微绒毛,染色质分布均匀,胞浆内可见丰富的内质网及排列规则的线粒体(图 4)。

【参考文献】

相关期刊论文 前5条

1 王强;曲彦隆;;Scx(Scleraxis)在肌腱组织工程中的研究进展[J];中国矫形外科杂志;2015年12期

2 付维力;陈刚;唐新;李棋;李箭;;BMP-12重组腺病毒载体转染外周血MSCs向肌腱/韧带细胞分化研究[J];中国修复重建外科杂志;2015年04期

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4 Xiao-Yong Liu;Jian Chen;Qing Zhou;Jing Wu;Xiao-Ling Zhang;Li Wang;Xiao-Yan Qin;;In vitro tissue engineering of lamellar cornea using human amniotic epithelial cells and rabbit cornea stroma[J];International Journal of Ophthalmology(English Edition);2013年04期

5 方宁;张路;宋秀军;章涛;陈代雄;;人羊膜间充质干细胞的分离、培养及鉴定[J];遵义医学院学报;2009年03期



本文编号:2833232

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