基于假病毒的基孔肯雅病毒（CHIKV）疫苗有效性评价方法研究

发布时间：2020-10-09 20:37

　　基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)是一种通过伊蚊传播的甲病毒,它在非洲、南亚、东南亚等地区周期性暴发,感染率极高~([1])。CHIKV感染导致基孔肯雅热(Chikungunya fever,CHIKF),患者会出现包括高热、关节疼痛、皮疹等临床症状,严重者可导致死亡~([2])。CHIKV已在全球100多个国家和地区出现,造成全球范围内每年大约100万人感染~([3])。2017年,WHO发布了10种优先研究的潜在传染病,CHIKF榜上有名。目前,尚无针对此病毒的疫苗和药物上市。由于研究CHIKV所需的实验室生物安全等级高,缺乏经济有效的动物模型,限制了针对此病毒的药物和疫苗研发。本课题的设计思路是构建高滴度的CHIKV假病毒,并建立可视化的假病毒小鼠感染模型,继而建立一套安全、全面、合理的体内外中和抗体检测方法,从而可在BSL-2实验室环境下,对疫苗有效性进行评价。本研究利用密码子优化后的CHIKV膜蛋白表达质粒pCMV3.1-CHIKV进行假病毒的构建,对影响假病毒滴度的因素进行优化,确定了包装条件:利用转染试剂lipo3000,以膜蛋白表达质粒pCMV3.1-CHIKV与骨架质粒pSG3Δenv.cmv.Fluc 1:2的比例转染293T细胞,48h后收取上清。最终制备的CHIKV假病毒滴度可达1.0×10~7TCID_(50)/mL。利用已构建的CHIKV假病毒在细胞水平建立中和活性检测方法并进行标准化研究。对假病毒敏感细胞、细胞和病毒加入量、检测时间等参数进行优化,确定其实验程序和参数为:将待测样品与400 TCID_(50)的CHIKV假病毒于96孔板混合孵育1h后,加入50000/孔的293T细胞,48h后检测发光值并计算中和抗体滴度。该方法为疫苗、单抗、小分子化合物等抗病毒制品的筛选和评价提供了平台。基于CHIKV高滴度假病毒,首次建立了CHIKV假病毒可视化小鼠感染模型。以尾静脉途径(IV)感染4周龄的BALB/c小鼠,利用活体成像技术,动态观察病毒在小鼠体内的分布和代谢,并确定了CHIKV假病毒感染BALB/c小鼠的AID_(50)为4.9×10~3TCID_(50)。该模型的建立,使得在BSL-2环境下对CHIKV疫苗进行体内有效性评价成为可能。此外,本研究成功构建了针对CHIKV的DNA疫苗,采用已建立的体外中和抗体检测方法,对DNA疫苗免疫的豚鼠和小鼠血清进行了检测,发现该疫苗可诱导豚鼠及小鼠产生高滴度中和抗体,抗体滴度(ID_(50))可达1:8000以上。利用已建立的小鼠模型,对免疫血清进行了小鼠体内被动保护效果评价,结果表明该抗血清对CHIKV假病毒感染小鼠具有保护作用,且保护效果与抗体滴度相关(R~2=0.66)。此外,本研究发现,提前给予小鼠GM-CSF刺激,并采用电穿孔技术辅助免疫,能使DNA疫苗诱导小鼠产生更高滴度的中和抗体(p0.0005),且抗体滴度与保护效果相关(R~2=0.73)。将被动免疫与主动免疫的保护效果进行比较后发现,两者的保护效果无显著性差异(p=0.37)。此结果肯定了中和抗体在抗CHIKV假病毒感染中发挥的主要作用。总之,本研究成功构建了高滴度CHIKV假病毒,并于国内外首次建立了可视化的CHIKV假病毒小鼠感染模型。基于此建立了安全性好、灵敏度高的体内外中和活性评价方法。此检测平台可在BSL-2实验室操作,对于药物、疫苗、单抗等抗病毒制品的有效性评价提供了理想的检测方法。
【学位单位】：中国食品药品检定研究院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R392
【部分图文】：

基因组,结构示意图

中国食品药品检定研究院硕士毕业论文非结构蛋白 nsP1 是一种含有 535 个氨基酸残基的棕榈酰化蛋白，具有甲基转移酶和鸟苷酰基转移酶的活性，参与病毒基因组 RNA 的合成[16]。nsP2 是一种 C-端具有蛋白水解结构域的多功能蛋白，表现出半胱氨酸蛋白酶活性[6, 17]。此外，nsP2 还具有三磷酸酶和解旋酶活性，参与 RNA 的加工[18]。nsP3 的功能不详，可能具有部分复制酶功能[13, 19]。nsP4 是 RNA 依赖的 RNA 聚合酶[20]。根据遗传谱系分析，CHIKV包括1个血清型，3个基因型：西非型（Western Africangenotype）、东-中-南非洲型（East-Central-Southern African genotype）、亚洲型（Asiangenotype）[21]。

病毒,IgG抗体,细胞,空斑减少中和试验

图 1.2 CHIKV 世界范围内流行区域[38]1.5 实验室检测由于 CHIKV、登革病毒（Dengue virus）和寨卡病毒（Zika virus）具有相似的临床感染症状，常用实验室检测技术将其区分开来[39]。针对 CHIKV，目前常用的实验室诊断方法有分离病毒、检测病毒 RNA、分子生物学及特异性抗体检测等[40]。CHIKV 通过血浆、血清或全血分离，之后可在体内外进行培养鉴定。Vero 细胞、BHK 21 细胞和 RD 细胞等都可用于 CHIKV 的分离培养。另外，可将病毒通过颅内注射乳鼠，实现体内培养传代。分离后的病毒可用血清学方法进行鉴定[40, 41]。CHIKV 的血清学检测主要包括间接免疫荧光法（Indirect immunofluorescenceassay，IFA）、酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、血凝抑制试验（Hemagglutionation inhibition，HI）和空斑减少中和试验（Plaquereduction neutralization test，PRNT）等。ELISA 可检测抗 CHIKV 特异性 IgM 和 IgG抗体，IgM抗体在病毒感染后4-7天即可检测出来，IgG抗体提示病人进入恢复期[42]

结构示意图,载体,疫苗载体,中国食品

中国食品药品检定研究院硕士毕业论文2 实验材料和方法料体表达载体 pcDNA3.1(+)达载体 pcDNA3.1(+)由本实验室保存，用于 CHIKV 膜蛋白的表疫苗载体 pDRVISV1.0苗载体 pDRVISV1.0 由中国疾病预防控制中心（CDC）邵一鸣教HIKV DNA 疫苗。

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