MA-5激活Mfn2相关线粒体自噬保护LPS损伤小胶质细胞

发布时间：2020-10-09 21:39

　　 目的:研究线粒体酸-5(mitochonic acid-5,MA-5)对LPS损伤小胶质细的保护作用及机制。方法1.MTT法检测小胶质细胞BV-2细胞活性,半胱天冬酶3(caspase-3)活性检测及TUNEL法检测细胞凋亡;2.通过JC1染色法、mPTP开放率及细胞内钙含量检测线粒体膜电位变化;3.使用siRNA沉默Mfn2,蛋白免疫印迹法(Western Blotting)检测Mfn2及凋亡蛋白半胱天冬酶-3(Caspase-3)、半胱天冬酶-9(Caspase-9)表达,并同时检测Caspase-3、Caspase-9活性;应用线粒体溶酶体荧光共定位观察线粒体自噬。4、ATP水平试剂盒检测线粒体ATP水平、免疫荧光检测细胞内ROS以及非氧化型心肌磷脂表达水平;5.通过Transwell检测以及细胞骨架肌动蛋白微丝F-actin免疫染色检测细胞迁移。结果1.MA-5保护小神经胶质细胞BV-2免受LPS诱导的细胞凋亡。与对照组相比,LPS能显着降低细胞活力,Caspase-3活性增加,增加细胞凋亡数量,使用MA-5后,能增加LPS处理后的BV-2细胞的活力,减少凋亡数量,表明MA-5保护小神经胶质细胞BV-2免受LPS诱导的细胞凋亡。2.MA-5抑制LPS诱导的线粒体损伤。MA-5使LPS处理的BV-2细胞线粒体膜电位升高,细胞内钙超载得到缓解,半胱天冬酶9(Caspase-9)及半胱天冬酶3(Caspase-3)活性及表达下降,表明MA-5抑制LPS诱导的线粒体损伤。3.MA-5增强Mfn2相关的线粒体自噬活性。MA-5干预后,LPS处理的BV-2细胞线粒体与溶酶体融合数量增加,Mfn2的表达升高,半胱天冬酶9(Caspase-9)活性增高,用siRNA沉默Mfn2,Mfn2表达下降,线粒体和溶酶体融合数量减少,半胱天冬酶9(Caspase-9)活性降低,表明MA-5增强了线粒体自噬活性,并依赖Mfn2的表达。4.MA-5激活的线粒体自噬增强细胞能量产生。MA-5能增加LPS处理后的BV-2细胞ATP水平,减少ROS的产生,减少心肌磷脂的氧化。siRNA沉默Mfn2后,MA-5的逆转作用消失。5.MA-5增强线粒体自噬促进LPS诱导的炎性损伤后BV-2细胞的迁移。MA-5能增加LPS处理后的BV-2细胞迁移数量,增加F-actin的表达,siRNA沉默Mfn2后,MA-5的逆转作用消失。表明MA-5增强线粒体自噬促进LPS诱导的炎性损伤后BV-2细胞的迁移。结论MA-5激活线粒体自噬能保护LPS损伤小胶质细胞BV-2,其机制可能是通过Mfn2所介导。
【学位单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R364.5
【部分图文】：

图 3.1 MA-5 以剂量依赖型方式缓解 LPS 诱导的 BV-2 细胞凋亡。A：MTT 法检测；B：Caspase 3的活性检测；C-D：TUNEL 检测细胞凋亡。*P＜0.05。3.2 MA-5 抑制 LPS 诱导的线粒体损伤为了进一步研究 MA-5 对 BV-2 细胞凋亡的保护作用，我们重点研究了线粒体损伤对细胞凋亡的影响，炎症相关的神经细胞损伤的机制之一是线粒体损伤引起的细胞凋亡[14]。我们用 JC-1 染色法测量了 LPS 诱导 BV-2 细胞线粒体膜电位的变化。结果表示，经 LPS 处理后，BV-2 细胞线粒体膜电位降低（图 3.2 A），红-绿荧光强度比值降低（图3.2 B）；MA-5 可逆转线粒体膜电位的这种变化。线粒体膜电位的丧失主要是由于过量的 mPTP 开放，这导致质子泄漏到细胞质中，导致代谢性酸中毒。我们通过钙黄素-AM来检测线粒体通透性转换孔mPTP的开放率，

图 3.2 A-B：JC-1 法检测线粒体膜电位；C：mPTP 的开放率检测。*P＜0.05。由于线粒体膜上 mPTP 的过度开放，线粒体将线粒体中的钙离子通过 mPTP 释放到细胞质中，导致细胞中钙超载[17]。我们使用钙离子荧光探针 Fluo-2 经流式细胞仪来分析细胞中的钙离子含量，我们发现 MA-5 的处理能缓解由 LPS 诱导的细胞钙超载(图3.3 A)。由于 mPTP 开放，线粒体中将促凋亡因子释放到细胞质中，促凋亡因子进一步促进 Caspase-9 和 Caspase-3 的激活。通过对 Caspase-9 和 Caspase-3 的活性检测，发现 LPS处理后，BV-2 细胞 Caspase-9 和 Caspase-3 的活性升高，这表明线粒体凋亡被激活；反之，经过 MA-5 处理，Caspase-9 和 Caspase-3 的活性降低（图 3.3 B-C）。以上结果表明，LPS 通过线粒体途径促进 BV-2 细胞凋亡，并且 MA-5 通过维持线粒体结构和功能，来抑制细胞凋亡。

图 3.3A：流式细胞仪检测细胞内钙离子水平；B：Caspase 3 活性检测；C：Caspase 9 活性检测；D：Western blot 结果。*P＜0.05。3.3 MA-5 增强 Mfn2 相关的线粒体自噬活性线粒体自噬可以清除和降解损伤的线粒体，维护线粒体稳态和正常生理功能，从而保护线粒体免受炎症损伤[48], 本部分主要是探讨 MA-5 是否是通过增强 Mfn2 相关的线粒体自噬来抑制 BV-2 细胞凋亡。首先，我们应用线粒体和溶酶体免疫荧光共染色的方法观察线粒体自噬活性。通过对线粒体和溶酶体的共染色，线粒体呈现绿色荧光，溶酶体呈现红色荧光，细胞核呈现蓝色荧光。经 LPS 的处理后，BV-2 细胞中与溶酶体融合的线粒体的数量水平降低，表明线粒体自噬的活性被抑制；MA-5处理的 BV-2 细胞中，与溶酶体特异性融合

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本文编号：2834233