人程序性死亡受体PD-1免疫组化用抗体的研制

发布时间：2020-10-10 20:13

　　 目的:本论文利用分子克隆的方法构建人源PD-1(hPD-1)的两种片段pET-22b-hPD-134-150和pET-22b-hPD-132-160的重组质粒,测序正确后,转化至原核表达系统BL21宿主菌,经IPTG诱导表达重组蛋白。hPD-1重组蛋白复性后,将高纯度的重组蛋白作为免疫原免疫Balb/c雌性小鼠,制备hPD-1蛋白的单克隆抗体,为制备具有病理诊断价值的单克隆抗体奠定一定的基础。方法:利用PCR扩增hPD-1胞外段基因,构建hPD-1重组质粒。将其转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达hPD-1蛋白后,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证,利用Ni-NTA柱亲和层析纯化包涵体表达的hPD-1蛋白,复性后由AKTA纯化系统进行分子筛凝胶过滤纯化。将纯化后的hPD-1蛋白作为免疫原免疫Balb/c雌性小鼠。免疫小鼠三次及一次加强免疫后取血,利用ELISA法测定血清的滴度,将血清滴度达到106的小鼠血清进行免疫组化(IHC)评价,最后利用杂交瘤技术制备anti-hPD-1单克隆抗体,利用ELISA法和IHC法筛选出效价高、IHC染色强、无非特异性染色的杂交瘤细胞株。最后对本论文制备的抗体进行亚型鉴定和纯化,利用SDS-PAGE检测纯化效果以及通过IHC和Western-blot评价anti-hPD-1单克隆抗体的性能。结果:1、成功构建pET-22b-hPD-134-150和pET-22b-hPD-132-160重组质粒,以终浓度0.5 mM IPTG于37℃诱导菌株6 h获得大量表达的hPD-1蛋白;2、利用所制备的hPD-1蛋白作为免疫原免疫Balb/c雌性小鼠,小鼠血清效价均达到106以上;IHC实验结果表明:膜定位较为清晰,阳性区域均出现较强染色;3、成功制备分泌anti-hPD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞,最终筛选出四株杂交瘤细胞11F5-C9、9C12-A3、9C12-C8、9C12-C9;其中9C12-C8细胞株产生的抗体亚型是重链为IgG2a,轻链为κ型。四株细胞产生的抗体应用于IHC上均具有清晰的膜定位,阳性区域强着色,背景干净且非特异性染色少,同时也可应用于Western-blot检测;结论:在大肠杆菌表达系统中表达hPD-132-160蛋白作为免疫原,成功制备特异性强、亲和力高的anti-hPD-1单克隆抗体,在IHC实验上可获得清晰的膜染色,达到商业化要求。
【学位单位】：福州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R392
【部分图文】：

原摄取与呈递功能，恢复促炎症因子ＴＮＦ－ｃｃ和ＩＬ－６的产生，进而恢复免疫细胞的活??性［３（）］。以上这些实验结果表明：ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌｓ途径能够抑制ＤＣ细胞的抗原摄取和递??呈功能，从而抑制免疫效应的产生。??１．２．２?ＰＤ－ｌ／ＰＤ－Ｌｓ途径介导Ｔ细胞抑芾ＩＪ??ＰＤ－１常以单体的形式表达于多种免疫细胞表面，在Ｔ淋巴细胞的表面也可检测??到ＰＤ－１的高表达。当Ｔ细胞表面ＰＤ－１受体与其配体ＰＤ－Ｌ１或ＰＤ－Ｌ２结合后，可负??性调控Ｔ细胞，导致Ｔ细胞免疫衰竭［３１］。其作用机制是：当ＰＤ－１识别其配体ＰＤ－Ｌｓ??并与之结合，使得ＰＤ－１胞浆区的ＩＴＳＭ蛋白序列磷酸化，进而募集酪氨酸磷酸酶??ＳＨＰ－１和ＳＨＰ－２。酪氨酸磷酸酶能使下游的效应分子磷脂酰肌醇激酶３?（ＰＩ３Ｋ）发生??去磷酸化，导致蛋白激酶Ａｋｔ活化诱导失败。Ａｋｔ的活化失败会抑制转录因子ＮＦ－ｋＢ??的活化，抗凋亡蛋白Ｂｃｌ－２与促生长转录因子Ｃ－ｍｙｃ表达下调，ＩＬ－２分泌及葡萄糖代??谢减少，从而抑制Ｔ细胞分化、增殖和细胞因子分泌。此外，ＳＨＰ－２也可使ＴＣＲ信??号相关的ＺＡＰ７０、ＣＤ－３；；及ＰＬＣ－ｙ去磷酸化，抑制下游信号［３２？］。??ＰＤ－Ｌ１??

??Ｊ??图１－１?ＰＤ－ｌ／ＰＤ－Ｌｓ途径介导Ｔ细胞抑制??进一步的研宄表明：ＰＤ－ｌ／ＰＤ－Ｌｓ途径对ＣＤ８＋Ｔ细胞的抑制效果要明显高于??ＣＤ４＋Ｔ细胞。由于ＣＤ４＋Ｔ细胞能够自分泌产生ＩＬ－２，?ＩＬ－２可以与Ｔ细胞表面的受体??３??

图１－３抗体结构图??
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本文编号：2835534