SFTSV感染靶细胞系的建立及转录组测序分析

发布时间：2020-10-10 23:55

　　 目的分离、纯化、培养鼠脾脏原代网状成纤维细胞(Fibroblastic reticular cells,FRCs),研究SFTSV对原代FRCs的感染特点及感染后FRCs基因表达的变化,了解其致死性感染的可能机制。永生化FRCs细胞,筛选出稳定与原代细胞功能接近的克隆株。方法使用磁珠分选和流式细胞分选等技术分离、纯化和体外培养小鼠脾脏网状成纤维细胞,并通过流式细胞术和激光共聚焦技术进行纯度鉴定;使用SV40大T抗原感染FRCs细胞,筛选、克隆并培养50代以上。使用Illumina Hi Seq 4000二代测序平台对感染SFTSV前、后原代FRCs,克隆细胞株,进行转录组测序(RNA-seq),测序结果进行基因表达分析、样品相关性分析、差异表达基因(DEG)分析以及DEG的Gene Ontology(Go)功能和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)pathway功能富集分析。结果成功分离、纯化、并体外培养脾脏原代FRCs细胞(纯度达99%);成功永生化FRCs细胞,得到两个符合表型的细胞克隆:Clone01、Clone02;Clone02形态与原代FRCs接近,多色流式细胞仪检测三种细胞纯度均达到了99%;细胞形态学、生长曲线及克隆实验提示Clone01变化较大;转录组测序相关性分析显示Clone02细胞株基因表达接近于原代FRCs,基因表达分析和激光共聚焦显微镜验证原代FRCs、Clone02的表型均为podoplanin和成纤维细胞抗体阳性、CD31阴性;转录组测序发现5914个感染前后的差异表达基因,其中2815个表达升高,3099个表达降低,差异表达基因分析选出了Asb13、Bbs1、Klhl8等显著变化最显著的十个差异表达基因。差异表达基因富集于33个GO term和20个KEGG Pathway,而GO功能分析结果显示质膜、高尔基体、内质网、免疫系统过程、翻译的RNA聚合酶II启动子调节、病毒颗粒、病毒颗粒成分等功能(GO terms)受到显著影响;Pathway功能分析结果表明SFTSV与人嗜T-淋巴病毒1型、人类单纯疱疹病毒和EB病毒的感染通路有部分相似,被感染后,FRCs的RNA聚合酶、核糖体及核糖体合成、m RNA的生存以及RNA的转运等途径有显著改变,Wnt、TNF、Notch、MAPK信号通路受到显著影响,另外赖氨酸降解和过氧化物酶途径也有改变。结论FRCs细胞可以短期体外培养并保持性状,体外可以被SFTSV感染;本实验建立了与原代细胞表型接近的FRCs细胞系Clone02,不表达造血细胞标志抗原CD45和表皮细胞标志抗原CD31,表达成纤维细胞标记(fibroblast)抗原和淋巴标记抗原podoplanin,保持了原代细胞的形态学、免疫学特征,是与原代FRCs基因表达接近的细胞株;Go和Pathways功能分析的结果可以部分相互验证,一致性较好。转录组测序结果为SFTSV感染FRCs提供了大量的线索,为进一步的研究提供参考和方向。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R373
【文章目录】：
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1 前言
2 材料与方法
3 结果
4 讨论
5 结论
6 参考文献
附录
致谢
综述
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本文编号：2835729