人源DNA聚合酶δ小亚基p50泛素化修饰分析
发布时间：2020-10-16 03:44
人源DNA聚合酶δ(Polδ)是由p125、p68、p50及p12四个亚基组成的异源四聚体,它不仅是染色体基因组复制最主要的DNA聚合酶,还参与了细胞内多种DNA损伤的修复过程。DNA聚合酶δ的高保真性及持续合成能力使得DNA能够准确、连续的复制,即:催化大亚基p125具有3’-5’核酸外切酶活性,能够保证DNA复制时掺入的碱基是正确配对的,即使发生小概率的错配,其错配的碱基也会被外切酶活性所切除,从而保证DNA复制的准确。除了在多种DNA损伤修复机制中发挥独有的作用外,Polδ自身还是一个DNA损伤响应的靶标,前期研究发现,在UV或烷化剂等损伤试剂诱导下产生的DNA损伤过程中,p12亚基通过UbcH5c/RNF8(E2/E3)介导的泛素-蛋白酶体途径降解,使得Polδ转变为对DNA损伤有更强识别和纠错能力的Polδ3形式以应对;我们前期的研究还发现,在相同的E2/E3调控系统下,p50亚基有被单泛素化修饰的迹象,但尚未获得最终的确认。鉴于p50亚基单泛素化修饰可能在跨损伤合成(修复)途径中介导Polδ与TLS聚合酶交换过程扮演重要角色,本论文研究首先通过建立的体外泛素化分析系统,以UbcH5c/RNF8及Rad6/Rad18这两种E2/E3调控系统对p50的单泛素化修饰进行了验证,同时对Polδ其他亚基的泛素化修饰情况也进行了分析,结果表明,两种E2/E3调控系统均能介导p50发生单泛素化修饰,且以UbcH5c/RNF8介导的p50单泛素化修饰程度更强,但这两种调控系统均不能介导p125和p68发生泛素化反应;UbcH5c/RNF8能够介导p12发生多泛素化反应,而Rad6/Rad18疑似能够介导p12的单泛素化反应。然后,利用UV射线处理培养的HeLa细胞,观察在DNA损伤情况下细胞内p50的泛素化修饰情况,发现在UV诱导产生DNA损伤的情况下,p50确实能够发生单泛素化修饰。最后,通过亚细胞定位实验,观察到Polδ能够与RNF8及TLS聚合酶Polε共定位到经UV射线处理所产生的损伤点(域),表明细胞内一旦发生DNA损伤,在p12经泛素-蛋白酶体途径降解的同时,Polδ以缺失了p12的三聚体形式Polδ3与RNF8及Polε(当然也包括其他多种修复相关的蛋白,例如PCNA等)被快速共募集到损伤点(域)参与跨损伤修复,此时,RNF8可能介导p50亚基发生单泛素化修饰。根据以上实验结果,我们假设了一种在TLS途径中基于p50单泛素化修饰的聚合酶交换机制。本论文研究为深入理解跨损伤合成(修复)途径中聚合酶Polδ与TLS聚合酶的交换机制,也为今后以Polδ作为小分子抑制剂的潜在的新靶标,设计新的肿瘤诊断、治疗手段来抗击人类疾病如癌症疾病等提供理论参考。
【学位单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R346
【部分图文】：
江苏大学硕士学位论文的骨架互作。锲入在核酸外切酶和手指结构域且与手掌结构域互作的 N-末端结构域（NTD）与模板链上未配对的部分互作，催化核苷酸转移反应的两个活性位点残基（Asp608 和 Asp764）位于“手掌”结构域，核酸外切酶活性位点残基Asp321、Glu323 和 Asp407 位于单一的 Ca2+附近。聚合酶和核酸外切酶活性位点的距离约为 45 。Sc Pol3p 三元复合体晶体结构的获得，使得具有重要功能的氨基酸残基的精确定位成为可能，也为 Pol 的遗传和功能研究提供了基础。
人源 DNA 聚合酶 小亚基 p50 泛素化修饰分析和中断复制（Break-induced replication, BIR），均受 C 亚基的调控[22-26]，因此，这显然依赖于 B 亚基与 C 亚基之间的互作，人源 p50 与 p66N端形成的复合体的晶体结构的获得极大地促进了对两者之间互作的理解。在 B 家族 DNA 聚合酶的 B 亚基之中，人源 Pol B 亚基的晶体结构是第一个获得的，这促进了对 B 亚基整体结构及其结构-功能关系的理解[27]。p50 与 C亚基 N-末端结构域 144 个氨基酸形成复合体，在下文中称为 p50·p66N。该结构像 一 个 扩 展 的 腰 果 形 分 子 ， 包 含 了 3 个 结 构 域 ： 磷 酸 二 酯 酶 样（Phosphodiesterase-like, PDE）表面结构域、p50 中的寡聚核苷酸/寡糖结合（oligonucleotide/oligosaccharide-binding,OB）结构域以及 p66N端的有翼螺旋-转角-螺旋（winged helix-turn-helix,wHTH）结构域（图 1.2）。PDE 结构域位于分子的中心，一侧与 OB 结构域结合，另一侧与 wHTH 结构域结合。
人源 DNA 聚合酶 小亚基 p50 泛素化修饰分析酸的 RNA 引物并且添加 10-20 个核苷酸的 DNA 以便进行延伸。随后，通过聚合酶交换机制由 RFC-PCNA-Pol 复合物替代了 Pol ，并且起始了新生后随链DNA 片段的持续合成[45-47, 50-55]。冈崎片段5’端附近产生的一些错误称为 片段，通常由 Pol 的核酸外切酶活性校正[56]。如果它们逃避了校正，将通过 Pol 催化的链置换合成来将其移除，这与正常的冈崎片段的成熟（Okazaki FragmentMaturation, OFM）有关[46, 48, 57]。因此，通常认为 Pol 负责后随链的合成。
【相似文献】
本文编号：2842706
【学位单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R346
【部分图文】：
江苏大学硕士学位论文的骨架互作。锲入在核酸外切酶和手指结构域且与手掌结构域互作的 N-末端结构域（NTD）与模板链上未配对的部分互作，催化核苷酸转移反应的两个活性位点残基（Asp608 和 Asp764）位于“手掌”结构域，核酸外切酶活性位点残基Asp321、Glu323 和 Asp407 位于单一的 Ca2+附近。聚合酶和核酸外切酶活性位点的距离约为 45 。Sc Pol3p 三元复合体晶体结构的获得，使得具有重要功能的氨基酸残基的精确定位成为可能，也为 Pol 的遗传和功能研究提供了基础。
人源 DNA 聚合酶 小亚基 p50 泛素化修饰分析和中断复制（Break-induced replication, BIR），均受 C 亚基的调控[22-26]，因此，这显然依赖于 B 亚基与 C 亚基之间的互作，人源 p50 与 p66N端形成的复合体的晶体结构的获得极大地促进了对两者之间互作的理解。在 B 家族 DNA 聚合酶的 B 亚基之中，人源 Pol B 亚基的晶体结构是第一个获得的，这促进了对 B 亚基整体结构及其结构-功能关系的理解[27]。p50 与 C亚基 N-末端结构域 144 个氨基酸形成复合体，在下文中称为 p50·p66N。该结构像 一 个 扩 展 的 腰 果 形 分 子 ， 包 含 了 3 个 结 构 域 ： 磷 酸 二 酯 酶 样（Phosphodiesterase-like, PDE）表面结构域、p50 中的寡聚核苷酸/寡糖结合（oligonucleotide/oligosaccharide-binding,OB）结构域以及 p66N端的有翼螺旋-转角-螺旋（winged helix-turn-helix,wHTH）结构域（图 1.2）。PDE 结构域位于分子的中心，一侧与 OB 结构域结合，另一侧与 wHTH 结构域结合。
人源 DNA 聚合酶 小亚基 p50 泛素化修饰分析酸的 RNA 引物并且添加 10-20 个核苷酸的 DNA 以便进行延伸。随后，通过聚合酶交换机制由 RFC-PCNA-Pol 复合物替代了 Pol ，并且起始了新生后随链DNA 片段的持续合成[45-47, 50-55]。冈崎片段5’端附近产生的一些错误称为 片段，通常由 Pol 的核酸外切酶活性校正[56]。如果它们逃避了校正，将通过 Pol 催化的链置换合成来将其移除，这与正常的冈崎片段的成熟（Okazaki FragmentMaturation, OFM）有关[46, 48, 57]。因此，通常认为 Pol 负责后随链的合成。
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本文编号：2842706
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