抗流感病毒中和抗体克隆与改造新方法探索研究

发布时间：2020-10-17 22:36

　　 研究背景流感是危害人类健康的重大社会公共卫生问题,每年在世界范围内造成25-50万人死亡~([1])。近年来报道的H1N1、H5N1、H7N9等流感疫情,更是向流感病毒防治的研究发出严重挑战。由于流感疫苗保护效果的不稳定性,以及抗流感病毒药物的疗效受限于严重的耐药问题,特别是流感重症病患的救治缺乏有效的治疗措施,抗病毒中和抗体被认为是一种更具潜力的治疗手段,通过优化单克隆抗体分离克隆技术以及抗体改造,是获得更好保护效果的中和抗体的更有效的研发策略。当前,基于荧光素酶的病毒中和实验和双异性抗体改造技术是用于抗体研发的重要方法。研究目的与方法本研究主要利用荧光流感病毒(IAV-Luc)微量中和的抗体筛选方法(BMN),并结合浆细胞单细胞培养和单细胞PCR技术,分离克隆抗流感中和抗体。同时使用DVD-Ig和Cross-Mab双特异抗体构建技术,研发可中和两种流感病毒的双特异性抗体。1.从免疫了季节性流感疫苗的志愿者外周血中分离浆母细胞,在含有IL-6的浆细胞培养体系中进行单细胞体外培养,使用低病毒量的荧光流感病毒微量中和法(BMN)筛选培养上清,对具有中和活性的孔细胞进行单细胞PCR获得抗体基因,抗体表达后进行HAI、病毒中和、抗原结合等活性分析检测。2.利用DVD-Ig和Cross-Mabs两种双特异抗体构建技术,将分别针对H1/California/7/2009和H5/Hong Kong/482/1997的中和抗体206与4E6的重链可变区和轻链可变区构建成双特异抗体,并比较单克隆抗体母本与双特异抗体的病毒中和和抗原结合活性的变化。研究结果:成功建立了利用BMN法测定单个浆细胞培养上清病毒中和活性的方法,并从病毒中和活性阳性的单个浆细胞中成功分离克隆获得了8株针对H1/CA09的中和抗体(Ab-2C、4E、3A、5A、B1、D5、4A、D7),而且Ab-2C、4E、3A、5A、B1、D5具有强中和H1/CA09病毒的活性,8个抗体均有H1/CA09 HA蛋白的结合活性。Ab-2C、4E、3A、4A和5A具有血凝抑制活性,表明它们是抗HA球部抗体。利用DVD-Ig或Cross-Mab双特异性抗体构建技术,成功构建体具备了针对H1/CA09和H5/HK97两种亚型流感病毒的双特异中和抗体。与母本抗体相比,双特异性抗体的病毒中和活性下降,而且基于Cross-Mab技术的双特异性抗体下降更明显。结论:直接利用单细胞PCR从单个B淋巴细胞中克隆抗体基因工作量大、效率低,而使用荧光流感病毒微量中和法测定单个B淋巴细胞培养上清的抗病毒中和活性,再从具有中和活性的B细胞中克隆抗体基因,可以提高获得中和抗体的效率,降低工作量。为后续的抗流感病毒中和抗体研发提供了一个高效的工具。同时,成功构建了基于DVD-Ig和Cross-Mab技术的抗H1/CA09和H5/HK97双特异性中和抗体,为开发针对不同亚型流感病毒的广谱中和抗体奠定了技术基础。
【学位单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R392
【部分图文】：

毒感染细胞过程中，无活性的 HA0 分子被裂解成 HA1 和 HA2，从而介导病毒与细胞膜结合与融合，这一过程赋予流感病毒感染性[3]。HA 蛋白成为目前流感疫苗研发的主要靶抗原，针对 HA 的中和抗体可阻断病毒的感染。因为流感病毒的高度变异性，针对 HA 的广谱中和抗体成为了近年来的研发焦点[14]。广州医科大学硕士学位论文

毒感染细胞过程中，无活性的 HA0 分子被裂解成 HA1 和 HA2，从而介导病毒与细胞膜结合与融合，这一过程赋予流感病毒感染性[3]。HA 蛋白成为目前流感疫苗研发的主要靶抗原，针对 HA 的中和抗体可阻断病毒的感染。因为流感病毒的高度变异性，针对 HA 的广谱中和抗体成为了近年来的研发焦点[14]。广州医科大学硕士学位论文

广州医科大学硕士学位论文结合方式来应对HA氨基酸多样性以及由group1和group2特异的糖基化而形成的结构限制[58.45.59-62]。由此可见，HA 蛋白茎部区域能更容易诱导产生广谱性更好的中和抗体，但是这类抗体的比例非常低，如何通过高效灵敏的方法大量筛选流感中和抗体，或者通过某种方法提高已有抗体的广谱性的探索，将有助于流感病毒广谱中和抗体研发。
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本文编号：2845398