Notch通路调控JunB的表达抑制BMP9诱导间充质干细胞成骨分化

发布时间：2020-10-18 19:42

　　 目的:研究Notch信号通路在骨形成蛋白9(Bone Morphogenetic Protein 9,BMP9)诱导小鼠间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)C3H10T1/2成骨分化过程中的作用及机制。方法:1.NICD过表达质粒转染间充质干细胞C3H10T1/2,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测质粒NICD在细胞中的转录水平表达,Western Blot(WB)检测NICD的蛋白表达水平。2.NICD及BMP9共同处理C3H10T1/2,通过检测碱磷酶(ALP)活性、染色及茜素红S染色明确NICD对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化过程的作用,RT-qPCR检测成骨分化过程中相关基因Runx2、OPN、OCN、JunB、Smad1、Id1、OSX 的转录水平表达,WB 检测 Runx2、OPN、OCN、JunB、Smad1/5/8、p-Smad1/5/8蛋白的表达水平。3 JunB基因的激动剂12-0-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(TPA)和Notch通路的抑制剂γ-分泌酶抑制剂(DAPT)分别与BMP9或NICD共同处理C3H10T1/2,ALP染色、活性及茜素红S染色检测成骨分化情况,WB再次检测上述成骨分化相关蛋白的表达水平。4.另外,集落形成实验检测细胞自我更新能力及流式细胞仪检测细胞周期变化,WB检测NICD对增殖相关蛋白PCNA、Cyclin D1表达水平的影响。5.BMP9、NICD或TPA处理后的细胞注入裸鼠背侧皮下异位成骨;MicroCT检测异位成骨参数骨体积(BV/TV)、骨小梁厚度(BV/TV)、骨小梁间距(Tb/Sp)、骨小梁数量(Tb/Sp)、骨密度(BMD)的差异情况,免疫组化检测成骨蛋白Runx2、OPN、OCN、JunB及成脂分化相关蛋白CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)在异位骨中的表达情况,苏木精-伊红染色、三色染色、阿新蓝染色检测异位骨中骨组织、软骨组织的生成情况,油红O染色检测异位骨中脂肪组织形成情况。结果:1.RT-qPCR及WB结果显示过表达NICD质粒在C3H10T1/2细胞中高表达;2.NICD可抑制BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化过程中成骨相关基因Runx2、OPN、OCN、OSX、JunB的表达及ALP形成和钙盐沉积,同时抑制成脂分化相关蛋白C/EBPα及PPARγ的表达,但不影响Smad1/5/8、p-Smad1/5/8的表达;3.基因JunB的激动剂TPA可逆转NICD抑制BMP9诱导成骨分化的作用,促进成骨分化基因Runx2、OPN、OCN、JunB的表达;4.Notch通路抑制剂DAPT促进成骨分化相关基因p-Smad1/5/8、Runx2、OPN、OCN、JunB的表达,但抑制早期成骨指标ALP形成,促进晚期成骨指标钙盐沉积;6.集落成集实验和流式细胞检测显示NICD明显促进细胞增殖,NICD促进增殖相关蛋白PCNA、CyclinD1的表达;7.异位成骨实验结果显示NICD明显抑制BMP9诱导的骨形成,免疫组化结果显示NICD抑制异位骨中成骨分化基因Runx2、OPN、OCN、JunB的表达,特殊染色HE、三色、阿新蓝、油红O染色显示NICD抑制异位骨中骨组织、软骨组织、脂肪组织的形成;8.TPA能逆转NICD对BMP9诱导成骨的抑制作用,促进成骨相关基因的表达及骨组织的形成。结论:NICD激活的Notch通路参与调控BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2成骨及成脂分化,通过下调基因JunB表达抑制BMP9诱导的成骨分化过程,但不影响BMP/Smad信号,且具有促进细胞增殖的作用。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R329.2
【部分图文】：

表达质粒激活Ｎｏｔｃｈ通路。ＮＩＣＤ质粒转染Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２细胞，４８ｈ后检测ＮＩＣＤ表??达。ＲＴ－ｑＰＣＲ结果显示，ＮＩＣＤ转录水平及Ｎｏｔｃｈ靶基因Ｈｅｙｌ、Ｈｅｓｌ较对照组明??显增加（图１Ａ）；?ＷＢ结果同样显示，与对照组相比，ＮＩＣＤ、ＢＭＰ９的蛋白表达水??平明显上升（图１Ｂ）。??Ａ?Ｂ??６〇－｜?□?ＢＭＰ９＋Ｃｏｎｔｒｏｌ??ｃ?■?ＢＭＰ９＋ＮＩＣＤ?ＢＭＰ９??？２??｜４０－?Ｉ?ＮＩＣＤ?＿??｜?２〇－?Ｉ?§?ｐ－ａｃｔｉｎ?—???＂Ｊ－ｌ?ｎｉ?－ｉ?－ｆ?，?／?／?，??＃?ｚ＃?，ｘ°?ｙ??图１．?ＮＩＣＤ、ＢＭＰ９在Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２细胞中高表达??Ｆｉｇ?ｌ．Ｔｈｅ?ｈｉｇｈ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＮＩＣＤ?ａｎｄ?ＢＭＰ９?ｉｎ?Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２?ｃｅＵｓ??（Ａ）?Ｔｈｅ?ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ?ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＮＩＣＤ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｗａｓ?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｂｙ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＮＩＣＤ?ｏｒ?ｔｈｅ??Ｎｏｔｃｈ?ｔａｒｇｅｔ?ｇｅｎｅ?Ｈｅｙｌ，?Ｈｅｓｌ，?Ｈｅｓ５?ｖｉａ?ＲＴ－ｑＰＣＲ．．（Ｂ）?Ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＮＩＣＤ?ｗａｓ?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｂｙ??ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ．??２．２?ＮＩＣＤ抑制ＢＭＰ９诱导的间充质干细胞成骨分化??为明确Ｎｏｔｃｈ信号通路在ＢＭＰ９诱导间充质干细胞成骨分化过程中的作用，??分别在ＮＣＥＤ或ＢＭＰ９处理细胞５ｄ、７ｄ后检测早期成骨指标ＡＬＰ表达，结果显??示

Ｂｌａｎｋ?ＮＩＣＤ?Ｃｏｎｔｒｏｌ??图５．?ＮＩＣＤ促进细跑增殖且维持间充质干细胞自我更新能力??Ｆｉｇ?５．?ＮＩＣＤ?ｉｓ?ｉｎｖｏｌｖｅｄ?ｉｎ?ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ?ｃｅｌｌｓ?ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ?ｂｏｎｅ?ｍａｒｒｏｗ??ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ?ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ??（Ａ）?Ｔｈｅ?ｃｅｌｌ?ｃｙｃｌｅ－ｒｅｌａｔｅｄ?ｇｅｎｅｓ?ＰＣＮＡ?ａｎｄ?ＣｙｃｌｉｎＤｌ?ｗｅｒｅ?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｂｙ?ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｉｎ?ｃｅｌｌｓ??

图７．ＮＩＣＤ抑制ＢＭＰ９诱导的间充质干细胞成脂分化??Ｆｉｇ，７?ＮＩＣＤ?ｉｎｈｉｂｉｔｓ?ＢＭＰ９－ｉｎｄｕｃｅｄ?ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＭＳＣｓ??（Ａ）?Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?Ｃ／ＥＢＰａ?ａｎｄ?ＰＰＡＲｙ?ｗａｓ?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｂｙ?ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔｔｉｎｇ?ａｆｔｅｒ?ｃｅｌｌｓ?ｗｅｒｅ?ｔｒｅａｔｅｄ??ｗｉｔｈ?Ａｄ－ＢＭＰ９，?ｔｈｅ?ＮＩＣＤ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｆｏｒ?９?ｄａｙｓ．?（Ｂ）?Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ?ｓｔａｉｎｉｎｇ?ｏｆ?ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ?ｓａｍｐｌｅｓ．?Ｆｒｏｚｅｎ??
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本文编号：2846729