莱茵衣藻BBSome组分蛋白BBS4的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

发布时间：2020-10-18 21:04

　　 目的为了探讨巴德特-别德尔综合征(BBS)蛋白在纤毛信号传导中的作用,本文研究了莱茵衣藻BBS4蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体制备。方法利用莱茵衣藻bbs4基因的cDNA序列构建原核表达载体pET-28a(+)-bbs4和pMAL-c2X-bbs4,转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)后,诱导表达得到带有麦芽糖结合蛋白(MBP)和6×His标签的融合蛋白,用纯化后的带有6×His标签的融合蛋白免疫新西兰白兔,经耳源静脉采血,分离得到抗血清,间接ELISA法测得抗血清的效价,Western印迹法和免疫荧光实验对所制备抗体的特异性进行检测。结果成功构建了原核表达质粒pET-28a(+)-bbs4和pMAL-c2X-bbs4。6×His-BBS4和MBP-BBS4融合蛋白的相对分子质量分别为4.5×104和8.5×104,经纯化后得到纯度85%、浓度0.5 mg/ml的目的蛋白用于免疫,测定效价为51 200,经Western印迹法对C. reinhardtii CC-125检测有较高的特异性,实现了莱茵衣藻BBS4蛋白的原核表达和多克隆抗体的制备。结论成功制备了莱茵衣藻BBS4的多克隆抗体,为BBS4在纤毛病中作用的深入研究奠定了基础。
【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 菌株与质粒
    1.2 实验动物
    1.3 试剂
    1.4 pET-28a(+)-bbs4和p MAL-c2X-bbs4原核表达载体的构建
    1.5 融合蛋白的表达
    1.6 融合蛋白的纯化
        1.6.1 6×His-BBS4融合蛋白的纯化
        1.6.2 麦芽糖结合蛋白（MBP)-BBS4融合蛋白的纯化
    1.7 多克隆抗体的制备
    1.8 ELISA测定的多克隆抗体效价
    1.9 BBS4抗体的纯化
    1.1 0 Western印迹法检测BBS4抗体
    1.1 1 免疫荧光实验
2 结果
    2.1 成功构建pET-28a(+)-bbs4和pMAL-c2X-bbs4原核表达载体
    2.2 融合蛋白成功表达
    2.3 获得纯化的6×His-BBS4融合蛋白
    2.4 获得纯化的MBP-BBS4融合蛋白
    2.5 抗血清效价的检测结果
    2.6 抗体的特异性分析结果
    2.7 免疫荧光实验结果
3 讨论

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