BMSC影响EPCs增殖、分化相关因子的研究
发布时间：2020-10-24 13:14
目的:本研究采用骨髓来源的血管内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs)和骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)作为研究细胞,拟通过两种细胞非接触式共培养,验证BMSC具有促进EPCs体外增殖和成管的作用,并研究EPCs的VEGFA、b-FGF等细胞因子及TRPC通道的表达情况,进一步阐明两种细胞共培养下BMSC促进EPCs的增殖、分化的作用以及相关因子的表达,为后续实验提供理论依据。方法:1.犬骨髓来源的EPCs和BMSC分离培养及鉴定实验:取健康杂种幼犬,1~2月龄,麻醉后于双侧胫骨行骨髓穿刺,抽取胫骨骨髓3ml。使用犬淋巴分离液密度梯度离心法配合条件诱导培养基分离培养犬骨髓EPCs;采用差速贴壁法分离培养犬BMSC;通过倒置相差显微镜观察并记录两种细胞的生长形态,体外EPCs诱导成管、BMSC诱导成骨实验及流式细胞仪检测细胞表面标志物鉴定细胞。2.共培养体系下EPCs增殖和成管实验:设立两实验组和一组对照组,共培养组收集BMSC及EPCs第2代细胞,使用Transwell非接触共培养,诱导组使用诱导培养基,对照组使用对照培养基。通过使用CCK-8检测三组EPCs增殖情况并绘制生长曲线,通过基质胶成管实验对比三组间EPCs成管能力,验证BMSC具有促进EPCs增殖、分化的生物学功能。3.共培养体系下EPCs细胞因子及TRPC通道的表达:设立共培养组、诱导组及对照组,并进行三个组的VEGFA、b-FGF、CD133、CD34、TRPC1、TRPC4免疫组化染色,测量各组平均光密度值进行对比。收集1d、3d、5d三个时间点各组EPCs提取总RNA使用qRT-PCR检测上述目标基因的表达水平并进行对比。结果:1.犬EPCs和BMSC体外分离培养实验及其鉴定:密度梯度离心法分离EPCs的细胞数量较少,纯度高,原代培养5d后EPCs镜下可见集落样生长细胞,细胞形态呈多角形或长条状。传代后延长培养时间,细胞呈典型的“铺路石”或“鹅卵石”样;成管诱导实验12h后可见EPCs成条索状排列形成管样结构;流式细胞仪检测第2代细胞,结果显示CD133与CD34呈阳性。通过差速贴壁法收集到的BMSC原代细胞较多。原代培养4h后BMSC开始贴壁,5d后镜下可见贴壁细胞增大,细胞形态呈条索或角形。成骨诱导分化实验21d后可见钙结节,茜素红染色呈阳性;流式细胞仪检测显示CD29阳性,HAL-DR阴性。2.使用CCK-8检测细胞增殖情况并绘制生长曲线,在BMSC与EPC共培养条件下EPCs生长对数期较其余两组提前,4d时共培养组对比其余两组差异有统计学意义(P0.05),4h后共培养组对比对照组差异有统计学意义(P0.05),8h后共培养组对比其余两组差异有统计学意义(P0.05)。3.共培养组VEGFA、b-FGF、TRPC1免疫组化结果呈阳性,对比其余两组差异有统计学意义(P0.05),共培养组TRPC4对比对照组差异有统计学意义(P0.05)。qRT-PCR检测培养1d后EPCs各组间的目标基因间差异不明显,培养3d后各目标基因间开始出现差异,培养5d后共培养条件下EPCs的VEGFA、b-FGF、TRPC1、TRPC4表达均高于其余两组,差异有统计学意义(P0.05),共培养组CD133相对其余两组有低表达的趋势。结论:1.BMSC在体外环境下可以促进EPCs的增殖能力及成管能力。2.EPCs在体外BMSC的促进下高表达VEGFA、b-FGF、TRPC1、TRPC4,通过这些目标基因的表达可以促进EPCs的生物学功能。共培养体系能够促进EPCs的成熟分化,CD133的下调趋势可能与此有关。
【学位单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R329.2
【部分图文】：
.2 犬内皮祖细胞成管腔实验成管诱导实验 12 小时后，EPCs 可见部分细胞排列成条索状，形成结构（图 2-A）。诱导 24 小时后可见管样结构增多（图 2-B）。图 1 倒置显微镜下 EPCs 细胞形态。（A）EPCs 原代细胞接种后（200x）。（B）EPCs 原代培养 5后（200x）。（C）EPCs 集落式生长融合（100x）。（D）EPCs 传代后延长培养时间（100x）。Figure 1 Morphology of EPCs under an inverted microscope.(A) EPCs Primary cells after inoculatio(200x). (B) After 5 d EPCs primary culture (200x). (C) EPCs colony growth fusion (100x). (D)Elongation of culture time after passage of EPCs (100x).
.3 内皮祖细胞流式细胞仪鉴定用流式细胞仪对第2代EPCs的表面标记物进行鉴定，结果显示CD13D34 表面标记物阳性（图 3）。AB图 2 倒置显微镜下 EPCs 成管实验。（A）EPCs 成管诱导实验 12 小时后（200x）。（B）EPCs 成管诱导 24 小时后（200x）。Figure 2 EPCs into tube experiments under an inverted microscope.(A) After 12 hours of EPCs tubeinduction experiment (200x). (B) EPCs tube induction 24 h later (200x).
.3 内皮祖细胞流式细胞仪鉴定用流式细胞仪对第2代EPCs的表面标记物进行鉴定，结果显示CD1D34 表面标记物阳性（图 3）。AB图 2 倒置显微镜下 EPCs 成管实验。（A）EPCs 成管诱导实验 12 小时后（200x）。（B）EPCs 成诱导 24 小时后（200x）。Figure 2 EPCs into tube experiments under an inverted microscope.(A) After 12 hours of EPCs tubeinduction experiment (200x). (B) EPCs tube induction 24 h later (200x).
【参考文献】
本文编号：2854512
【学位单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R329.2
【部分图文】：
.2 犬内皮祖细胞成管腔实验成管诱导实验 12 小时后，EPCs 可见部分细胞排列成条索状，形成结构（图 2-A）。诱导 24 小时后可见管样结构增多（图 2-B）。图 1 倒置显微镜下 EPCs 细胞形态。（A）EPCs 原代细胞接种后（200x）。（B）EPCs 原代培养 5后（200x）。（C）EPCs 集落式生长融合（100x）。（D）EPCs 传代后延长培养时间（100x）。Figure 1 Morphology of EPCs under an inverted microscope.(A) EPCs Primary cells after inoculatio(200x). (B) After 5 d EPCs primary culture (200x). (C) EPCs colony growth fusion (100x). (D)Elongation of culture time after passage of EPCs (100x).
.3 内皮祖细胞流式细胞仪鉴定用流式细胞仪对第2代EPCs的表面标记物进行鉴定，结果显示CD13D34 表面标记物阳性（图 3）。AB图 2 倒置显微镜下 EPCs 成管实验。（A）EPCs 成管诱导实验 12 小时后（200x）。（B）EPCs 成管诱导 24 小时后（200x）。Figure 2 EPCs into tube experiments under an inverted microscope.(A) After 12 hours of EPCs tubeinduction experiment (200x). (B) EPCs tube induction 24 h later (200x).
.3 内皮祖细胞流式细胞仪鉴定用流式细胞仪对第2代EPCs的表面标记物进行鉴定，结果显示CD1D34 表面标记物阳性（图 3）。AB图 2 倒置显微镜下 EPCs 成管实验。（A）EPCs 成管诱导实验 12 小时后（200x）。（B）EPCs 成诱导 24 小时后（200x）。Figure 2 EPCs into tube experiments under an inverted microscope.(A) After 12 hours of EPCs tubeinduction experiment (200x). (B) EPCs tube induction 24 h later (200x).
【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 Hadar Zigdon-Giladi;Utai Rudich;Gal Michaeli Geller;Ayelet Evron;;Recent advances in bone regeneration using adult stem cells[J];World Journal of Stem Cells;2015年03期
2 谭科芳;孙璇;;内皮祖细胞移植治疗的研究进展和临床应用前景[J];中南大学学报(医学版);2014年11期
本文编号：2854512
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