烟曲霉Hsp70和Hyp1基因的克隆与表达研究

发布时间：2017-04-04 14:11

  本文关键词：烟曲霉Hsp70和Hyp1基因的克隆与表达研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：自然界存在10万多种真菌,仅有300多种能抵抗人类的体表温度引起感染,尤其是免疫功能低下者或是生命垂危患者。目前感染的主要病原菌仍然是念珠菌,但曲霉菌、隐球菌等也在不断增加,尤其是曲霉菌,估计全球每年有20万侵袭性曲霉感染(IA)病例,虽然曲霉菌的感染率仅次于念珠菌,但是其死亡率却远高于念珠菌感染,达40%~90%。曲霉菌属中以烟曲霉感染致病最为常见,占IA的90%~95%,这主要归因于其无处不在的分生孢子。IA的高发病率和死亡率,决定了其早期诊断及时治疗的重要意义和价值。由于缺乏快速准确的诊断方法,加上IA患者早期临床症状不明显,往往延误了最佳的治疗时机。近年来,由于分子生物学和免疫学的飞速发展,越来越多的研究者把目光聚集在血清学检测,以期找到特异的抗原或抗体系统。本研究在课题组前期比较蛋白质组学的基础上,筛选烟曲霉细胞壁蛋白热休克蛋白70(Hsp70)和疏水蛋白(Hyp1)为目标,通过Gen Bank查找其基因序列,拟构建烟曲霉Hsp70和Hyp1基因的重组质粒,在原核表达载体大肠杆菌中诱导表达,为后续探讨Hsp70和Hyp1抗原、抗体系统在诊断侵袭性烟曲霉感染中的价值和意义奠定基础。根据Genbank报道的烟曲霉Hsp70和Hyp1基因序列,设计特异引物,以烟曲霉IFM40808的c DNA为模板,PCR扩增目的基因;通过基因的克隆与亚克隆,将目的基因与表达质粒Pet28a(+)连接;将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的基因的表达,通过SDS-PAGE分析表达产物;纯化表达产物并进行Western-blot定性分析和BCA定量分析。结果:1.经PCR分别扩增出1366bp和769bp的Hsp70和Hyp1基因核苷酸序列与Gen Bank中公布的序列基本一致。2.构建了含重组质粒p ET28a(+)-Hsp70和p ET28a(+)-Hyp1的大肠杆菌工程菌,经IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE分析表达产物的大小与预期基本一致。3.对包涵体形式的目的蛋白Hsp70,进行变性溶解和复性,获得比较均一的目的蛋白。4.Western-blot分析诱导表达的目的蛋白Hsp70和Hyp1能与抗His-tag的小鼠单抗相互结合,BCA定量分析目的蛋白Hsp70浓度为900ug/m L。结论:1.构建了烟曲霉Hsp70和Hyp1基因的原核表达质粒p ET28a(+)-Hsp70和p ET28a(+)-Hyp1。2.Hsp70和Hyp1基因的原核表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达目的蛋白。为下一步研究其在鉴定诊断侵袭性烟曲霉感染中的作用和地位奠定了基础。
【关键词】：烟曲霉 热休克蛋白70 疏水蛋白 克隆 表达
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R379
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文缩略词10-11
• 第一章 绪论11-21
• 1.1 侵袭性曲霉感染概述11-12
• 1.2 侵袭性曲霉感染诊断研究进展12-16
• 1.2.1 痰培养12
• 1.2.2 组织病理学检查12
• 1.2.3 影像学检查12-13
• 1.2.4 新型检测方法13-14
• 1.2.5 血清学检测14-16
• 1.3 烟曲霉热休克蛋白Hsp7016-17
• 1.4 烟曲霉疏水蛋白Hyp117-18
• 1.5 包涵体18-20
• 1.5.1 包涵体的形成机制18-19
• 1.5.2 包涵体的优势19
• 1.5.3 包涵体的复性19-20
• 1.6 研究目的和意义20
• 1.7 研究内容20-21
• 第二章 烟曲霉Hsp70基因的克隆、表达及表达产物的纯化21-44
• 2.1 实验材料21-25
• 2.1.1 菌株和质粒21
• 2.1.2 PCR引物设计与合成21
• 2.1.3 主要仪器设备21-22
• 2.1.4 主要试剂22-23
• 2.1.5 主要试剂和培养基的配制23-25
• 2.2 实验方法25-35
• 2.2.1 烟曲霉Hsp70基因的扩增25-27
• 2.2.2 克隆载体pMD19T- Hsp70的构建27-30
• 2.2.3 原核表达载体pET28a- Hsp70的构建30-31
• 2.2.4 Hsp70的诱导表达31
• 2.2.5 溶解包涵体31-32
• 2.2.6 纯化表达蛋白32-33
• 2.2.7 纯化蛋白定性定量分析33-35
• 2.3 结果与分析35-42
• 2.3.1 烟曲霉Hsp70基因的扩增35
• 2.3.2 鉴定pMD19T- Hsp70阳性克隆35-38
• 2.3.3 重组质粒pET28a- Hsp70的鉴定38-40
• 2.3.4 Hsp70的表达40-42
• 2.4 讨论42-44
• 第三章 烟曲霉Hyp1基因的克隆表达及表达条件优化44-51
• 3.1 实验材料44
• 3.2 实验方法44-45
• 3.3 结果45-50
• 3.3.1 烟曲霉Hyp1基因的扩增45-46
• 3.3.2 鉴定pMD19T- Hyp1阳性克隆46-47
• 3.3.3 重组质粒pET28a- Hyp1的鉴定47-48
• 3.3.4 Hyp1的表达48-49
• 3.3.5 Western-blot分析目的蛋白49
• 3.3.6 诱导条件的优化49-50
• 3.4 讨论50-51
• 第四章 讨论51-53
• 第五章 结论53-54
• 参考文献54-62
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果62-63
• 致谢63

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 徐小勇;施毅;;烟曲霉侵袭机制的研究[J];中国呼吸与危重监护杂志;2010年01期

2 李华信,刘云金,贾鸣;烟曲霉菌引起肺部严重感染1例分析[J];中华医院感染学杂志;2003年02期

3 崔龙秀;烟曲霉菌致曲霉性肺炎1例[J];中华医院感染学杂志;2004年10期

4 王迎华;曹郁生;高丹丹;;烟曲霉检测技术研究进展[J];食品科技;2007年04期

5 卢青虎,其布热,侯小平;烟曲霉菌引起脑炎一例报告[J];浙江临床医学;2002年04期

6 王露霞,徐德兴,罗春梅,符玉文,姜志勇;从胸水和脑脊液中分离出烟曲霉菌一例[J];中华检验医学杂志;2003年03期

7 肖浩文;蒋祖军;肖扬;高扬;张小明;庞妍;欧阳玲;;异基因造血干细胞移植1年后发生肺烟曲霉菌病合并闭塞性细支气管炎1例(英文)[J];中国组织工程研究与临床康复;2010年27期

8 毛晓露;卢忠心;石小燕;张文静;;双重荧光定量聚合酶链反应检测烟曲霉菌与黑曲霉菌的临床应用[J];中华医院感染学杂志;2013年19期

9 吴恒义,刘坚,胡建平,宋骤,陈青山,杨明常,陈芳;1例罕见烟曲霉菌多发性感染抢救成功的体会——求实和负责是关键[J];现代医院;2003年01期

10 郝飞;烟曲霉的致病因子及作用机制的研究进展[J];中华医院感染学杂志;2004年01期

中国重要会议论文全文数据库 前4条

1 ;致病及过敏性烟曲霉菌的基因组编码序列测定[A];第六届全国优生科学大会论文汇编[C];2006年

2 冯素娥;张选钧;;烟曲霉菌致曲霉性支气管咯血1例[A];2005全国首届深部真菌感染学术会议论文集[C];2005年

3 王红旗;王慧芬;李波;李永利;;左侧胸水检出烟曲霉菌一例报告[A];2005全国首届深部真菌感染学术会议论文集[C];2005年

4 顾克菊;马越云;苏明权;杨军兰;郝晓柯;于文彬;;免疫抑制小鼠侵袭性肺烟曲霉菌病动物模型的建立及致病机理的研究[A];第6次全国微生物学与免疫学大会论文摘要汇编[C];2004年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 陈先华;烟曲霉对造血干细胞移植患者中性粒细胞吞噬功能的影响及机制研究[D];第三军医大学;2015年

2 张宇;用比较蛋白质组学研究烟曲霉的致病机制[D];吉林大学;2010年

3 高磊;天然药物小檗碱抑制烟曲霉作用机制的研究[D];吉林大学;2012年

4 廖军;肺泡巨噬细胞与烟曲霉相互作用的实验研究[D];第三军医大学;2005年

5 李先平;烟曲霉磷脂酶D基因敲除及其功能研究[D];青岛大学;2012年

6 史利宁;免疫蛋白质组学法鉴定烟曲霉免疫优势抗原及其在侵袭性曲霉病早期诊断中的应用[D];江苏大学;2012年

7 曾荣;烟曲霉和念珠菌属体外药敏实验相关研究[D];北京协和医学院;2014年

8 龙飞;烟曲霉菌对呼吸道上皮细胞结构和功能的影响[D];上海交通大学;2008年

9 龙朝钦;根癌农杆菌介导转化对烟曲霉chsC基因的功能研究[D];第三军医大学;2008年

10 张辉军;NOD蛋白在烟曲霉感染小鼠肺组织中的表达及对烟曲霉孢子的识别机制[D];复旦大学;2006年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 廖新辉;重组酶介导等温核酸扩增技术快速检测烟曲霉菌[D];第二军医大学;2015年

2 李水秀;汉防己甲素对伊曲康唑和伏立康唑抗烟曲霉增效活性及其主要机制研究[D];暨南大学;2015年

3 郝祥蕊;烟曲霉Hsp70和Hyp1基因的克隆与表达研究[D];吉林大学;2016年

4 陈先华;烟曲霉对人中性粒细胞结构和功能的影响[D];第三军医大学;2008年

5 郑东宇;烟曲霉诱导宿主细胞吞噬过程中磷脂酶D的激活及其功能研究[D];苏州大学;2010年

6 唐梦丹;我国不同地域烟曲霉临床分离株基因型分析[D];福建医科大学;2013年

7 周万青;侵袭性烟曲霉感染早期病原学诊断方法研究[D];江苏大学;2009年

8 杨梅;烟曲霉Afmp1cr/Afmp2cr抗体免疫学检测方法的建立及评价[D];南方医科大学;2014年

9 梁立;烟曲霉Zeta类谷胱甘肽转移酶基因的克隆表达及生物信息学研究[D];吉林大学;2008年

10 牛晓璐;烟曲霉诱导的PKD1-NF-κB通路的激活及相关炎症因子的表达调控[D];南方医科大学;2013年

  本文关键词：烟曲霉Hsp70和Hyp1基因的克隆与表达研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：285664