东方田鼠抗日本血吸虫童虫的相关基因作用机制的初步研究

发布时间：2020-10-26 12:55

　　 血吸虫病是一种严重危害人民身心健康的人兽共患寄生虫性传染病,在我国仍然是一个重要的公共卫生问题。流行病学调查和人工感染实验研究结果表明：东方田鼠Microtus fortis)是日本血吸虫的非适宜宿主,也是唯一一种对日本血吸虫具有天然抗性、感染血吸虫后不致病的哺乳动物。在前期实验的基础上,本研究通过蓝色琼脂糖凝胶亲和层析,直接从东方田鼠血清中分离、纯化获得了一个对日本血吸虫童虫具有显著杀伤作用的蛋白——白蛋白。为了进一步了解东方田鼠血清白蛋白抗日本血吸虫的作用机理,我们用FITC标记东方田鼠血清白蛋白,来追踪其在日本血吸虫童虫体内的作用部位,应用日本血吸虫肠道内的组织蛋白酶Legumain来消化东方田鼠血清白蛋白,并构建了东方田鼠血清白蛋白的真核表达载体,制备条件培养基,验证了其表达产物对日本血吸虫童虫的杀伤效果。 ILKAP是本课题组从东方田鼠骨髓细胞cDNA文库中筛选出来的一种抗性基因,本研究利用东方田鼠骨髓蛋白与日本血吸虫童虫蛋白通过免疫共沉淀实验,联合MALDI-TOF-MS分析,鉴定出与ILKAP作用的8种相关蛋白,接着将基因ILKAP和Tegument antigen (TA)分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)b和pCMV-Tag2b,共转染HEK293T细胞后,通过免疫共沉淀和Western blotting验证了ILKAP和Tegument antigen的相互作用,为进一步阐明其在抗日本血吸虫的作用机制及发现新的抗性相关蛋白提供线索。 一、东方田鼠血清白蛋白的分离、纯化、鉴定及对日本血吸虫童虫的杀伤效果 实验通过蓝色琼脂糖凝胶层析柱分离得到东方田鼠血清白蛋白溶液,透析、冷冻干燥后,通过10%SDS-PAGE电泳进行分析。将纯化的白蛋白与体外培养的日本血吸虫童虫共孵育,实验结果显示：东方田鼠白蛋白浓度为2.5mg/m1时,童虫死亡率为37.94%(P0.05),随着白蛋白浓度的增加,童虫死亡率也增加,与对照组相比,具有统计学意义。 二、东方田鼠血清白蛋白条件培养基的制备及对日本血吸虫童虫的杀伤效果 本实验将东方田鼠白蛋白基因重组到真核表达载体pcDNA3.1(+),制备东方田鼠白蛋白的条件培养基,检测其真核表达产物体外杀伤日本血吸虫童虫效果。实验结果显示：东方田鼠albumin的条件培养基杀虫率为38.7%(P0.05),与对照组相比具有显著的杀虫效果。 三、东方田鼠血清白蛋白在日本血吸虫童虫体内的定位及Legumain对东方田鼠血清白蛋白的消化 将荧光素(FITC)标记的东方田鼠血清白蛋白与日本血吸虫童虫共孵育,白蛋白终浓度为5mg/ml,于37℃、5%CO2环境中培养童虫。24h及48h后分别收获童虫,于OLYMPUS倒置荧光显微镜下观察荧光出现的部位。结果发现,FITC标记的东方田鼠血清白蛋白与日本血吸虫童虫共孵育24h后,在童虫肠道内有荧光素聚集,孵育48h后,荧光素在童虫肠道内的聚集更加明显。 为了进一步了解东方田鼠抗日本血吸虫童虫的作用机制,我们分析了日本血吸虫肠道内常见的几种内肽酶：组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、组织蛋白酶L和组织蛋白酶AE。通过文献资料查阅和序列分析发现：只有Legumain对东方田鼠和小白鼠白蛋白的氨基酸序列有切割位点的变化。因此我们利用Legumain分别消化东方田鼠和小白鼠血清白蛋白。结果发现：Legumain对东方田鼠和小白鼠血清白蛋白的消化存在显著差异。 四、与ILKAP相互作用的日本血吸虫童虫蛋白的筛选 在早期抗日本血吸虫研究中,课题组建立了东方田鼠骨髓细胞cDNA文库,通过表达克隆法对该文库进行抗性基因的筛选,从gE77次级亚基因池中筛选到抗性候选基因gE77.43,其编码的产物为整合素连接激酶相关丝氨酸／苏氨酸磷酸酶(ILKAP)。前期研究首次发现ILKAP具有显著的杀伤日本血吸虫童虫的效果。因此,本研究利用东方田鼠骨髓蛋白与日本血吸虫童虫蛋白,通过免疫共沉淀实验,联合质谱分析鉴定与8种与ILKAP相互作用的血吸虫童虫蛋白质。 五、与ILKAP相互作用的日本血吸虫童虫蛋白的验证 东方田鼠骨髓蛋白与日本血吸虫童虫蛋白通过免疫共沉淀实验和质谱分析共筛选了8个可能与ILKAP相互作用的血吸虫童虫蛋白质。为进一步验证筛选出来的蛋白质是否与ILKAP存在相互作用,本实验采用免疫共沉淀结合Western blotting发现童虫蛋白TA确实与ILKAP存在直接相互作用。本研究利用脂质体分别将Myc-TA-pcDNA3.1/(-)b和Flag-ILKAP-pCMV-2b转染至HEK293T细胞,建立ILKAP-Flag和TA-Myc高表达的HEK293T细胞；通过免疫共沉淀实验证实了日本血吸虫蛋白TA与东方田鼠骨髓ILKAP之间的相互作用,为进一步阐明东方田鼠抗日本血吸虫的作用机制及发现新的靶作用位点提供线索。
【学位单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2014
【中图分类】：R383.24
【部分图文】：

1东方田鼠白蛋白的分离、纯化及对日本血吸虫的杀伤效果洗脱曲线如图1-1。图示结果显示目的峰与前锋分离彻底，呈抛物线，且无脱尾现象和其他杂峰，表明透析处理后的血清经蓝色琼脂糖亲和层析后，分离效果好，可用于后续实验分析。SDS-PAGE分析处理后的白蛋白纯度，如图1-2,图示结果显示PAGE胶中只有单一的一条带，进一步表明处理后的血清经蓝色琼脂糖亲和层析后纯度较高，几乎无其他蛋白质干扰。r -* ..……”￡-： ..二 ? _ 地. ~ ~.J—,.： — ."niy.',-.' ‘ "".'.fjiii' --- 二二,i■二 ???——v-?- ..一，…士-I-.””"十■- 1‘ T III丨.11: '? ■■■—“-圓 I三 =: J _2 r "”二：. -二 …：二 ‘.卜:-‘V —"T. B?. z I 1 ■*- -. 一- ."3~ ~ 1 \ . . 3 \ “ -- \：二:l^ ： “ "一 “ - * “‘ \ -5?-,^ ._:J— _ = ^ ^图1-1蓝色球脂糖凝胶FF亲和色谱分离东方田鼠血清白蛋白的洗股图Fig. 1-1 Elution profile of A^Tserum albumin with Blue Sepharose FF affinity chromatographicfractionation1:球蛋白 2:白蛋白1: A^serum globulin, 2: A/f serum albuminm PMT,； -1”'-1 OQ 70 巧.：50——nil35——25七難图1-2亲和层析纯化后白蛋白的SDS-PAGE图Fig. 1-2 SDS-PAGE of j\^semm albumin purified with Blue Sepharose FF affinitychromatographyM:宽范围蛋白质分子量标准1:东方田鼠血清白蛋白Lane M: Broad range protein molecular weight marker (100 kD, 70 kD，50 kD

现象和其他杂峰，表明透析处理后的血清经蓝色琼脂糖亲和层析后，分离效果好，可用于后续实验分析。SDS-PAGE分析处理后的白蛋白纯度，如图1-2,图示结果显示PAGE胶中只有单一的一条带，进一步表明处理后的血清经蓝色琼脂糖亲和层析后纯度较高，几乎无其他蛋白质干扰。r -* ..……”￡-： ..二 ? _ 地. ~ ~.J—,.： — ."niy.',-.' ‘ "".'.fjiii' --- 二二,i■二 ???——v-?- ..一，…士-I-.””"十■- 1‘ T III丨.11: '? ■■■—“-圓 I三 =: J _2 r "”二：. -二 …：二 ‘.卜:-‘V —"T. B?. z I 1 ■*- -. 一- ."3~ ~ 1 \ . . 3 \ “ -- \：二:l^ ： “ "一 “ - * “‘ \ -5?-,^ ._:J— _ = ^ ^图1-1蓝色球脂糖凝胶FF亲和色谱分离东方田鼠血清白蛋白的洗股图Fig. 1-1 Elution profile of A^Tserum albumin with Blue Sepharose FF affinity chromatographicfractionation1:球蛋白 2:白蛋白1: A^serum globulin, 2: A/f serum albuminm PMT,； -1”'-1 OQ 70 巧.：50——nil35——25七難图1-2亲和层析纯化后白蛋白的SDS-PAGE图Fig. 1-2 SDS-PAGE of j\^semm albumin purified with Blue Sepharose FF affinitychromatographyM:宽范围蛋白质分子量标准1:东方田鼠血清白蛋白Lane M: Broad range protein molecular weight marker (100 kD, 70 kD，50 kD，35 kD, 25 kD).14

不同浓度东方田鼠血清白蛋白与日本血吸虫童虫共培养，在96 h内连续观察白蛋白培养的童虫，计算活童虫数，统计童虫死亡率（图1-3、1-4)。观察结果显示，2.5 mg/ml的东方田鼠血清白蛋白的杀虫率为37.94%, 5 mg/ml的东方田鼠血清白蛋白的杀虫率为43.25%，10 mg/ml的东方田鼠血清白蛋白的杀虫率为杀虫率为48.3%,阳性对照含20%的东方田鼠血清其杀虫率为33.92%，阴性对照10 mg/ml的昆明小鼠白蛋白其杀虫率为12.36%，实验结果显不：纯化后的东方田鼠白蛋白和阳性对照血清对童虫具有很强的杀伤作用，童虫死亡率明显高于昆明小鼠血清白蛋白阴性对照处理组。童虫培养96 h后，显微镜下可见：活童虫结构完整，能伸缩轜动
【参考文献】

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本文编号：2857025