烟碱型乙酰胆碱受体在面神经支配的口轮匝肌和躯体神经支配的腓肠肌中的表达差异研究
发布时间：2020-10-26 10:31
目的:研究烟碱型乙酰胆碱受体在在面神经支配的口轮匝肌和躯体神经支配的腓肠肌运动终板处的表达差异及可能的原因。方法:分离SD大鼠的口轮匝肌和腓肠肌,通过免疫共沉淀技术计算口轮匝肌和腓肠肌肌肉特异性激酶(Muscle Specific Kinase,Mu SK)的表达以及MuSK磷酸化水平。对MuSK的上游信号通路中能使其发生磷酸化的集聚蛋白Agrin、低密度脂蛋白受体相关蛋白4 (low-density lipoprotein receptor-related protein 4, Lrp4)以及表皮生长因子家族受体ErbB2、ErbB3和ErbB4(epidermal growth factor receptor)免疫荧光染色,计算这两条不同通路中的蛋白在运动终板处的表达水平。结果:口轮匝肌中MuSK磷酸化水平显著高于腓肠肌(P0.05)。口轮匝肌与腓肠肌的运动终板处的Agrin和Lrp4表达没有显著差异(P0.05)。口轮匝肌ErbB2、ErbB3、ErbB4的表达显著高于其在腓肠肌运动终板处的表达(P0.01)。结论:口轮匝肌和腓肠肌运动终板ErbB、ErbB3、ErbB4的差异表达造成MuSK磷酸化水平不同,可能是两种肌肉运动终板处烟碱型乙酰胆碱亚基表达量不同的原因。
【部分图文】：
利用免疫共沉淀技术，我们发现在100 kD条带的位置，MuSK在两种肌肉中的表达并无差异。然而通过计算4G10（磷酸化的MuSK）条带的强度与MuSK条带强度的比值，得出口轮匝肌中MuSK磷酸化程度高于腓肠肌中MuSK磷酸化水平(63.7%±2.26-45.3%±3.27,P<0.05,n=20)。结果见图1。2.2 口轮匝肌和腓肠肌中运动终板处Agrin、Lrp4和MuSK的表达比较
对腓肠肌和口轮匝肌运动终板处的Agrin,Lrp4和MuSK进行荧光染色。α-BTX（α-bungarotoxin）是一种银环蛇毒素，可以特异性结合nAchRs的α1亚基，用于标记运动终板。Agrin在口轮匝肌中运动终板的荧光密度(0.07959±0.005334)与腓肠肌(0.08235±0.004976)中差异无统计学意义(P>0.05,n=20),Lrp4(0.04213±0.002265-0.04122±0.002043)和MuSK(0.04829±0.002214-0.04267±0.002098)也无显著差异(P>0.05,n=20)，结果见图2。2.3 口轮匝肌和腓肠肌中运动终板处ErbB2,ErbB3和ErbB4的表达
在胚胎发育过程中，肌肉会预先选定运动终板位置，并引导神经末梢的的生长，最终形成完整的突触的结构，而表达于肌细胞膜上的MuSK蛋白在这一过程中起决定性的作用。在MuSK突变的的肌管和小鼠胚胎中，运动终板的突触前和突触后的的正常结构都无法形成。MuSK在体外培养的成肌细胞中以低水平表达，同时动物实验证明在胚胎早期，MuSK特异性表达于发育中的肌肉，但MuSK的水平在成熟肌肉中却显著下降，仅在神经肌肉接头处的表达和分布[20]。突触后膜nAchRs的形成和聚集是运动终板成熟的标志，这一过程和MuSK表达和被激活发生磷酸化息息相关[21,22]。在MuSK基因敲除小鼠或从突变体提取和培养的肌管中，nAChRs不能在运动终板处聚集，甚至失去了突触特异性nAChRs表达和转录能力。然而，MuSK对于n AChRs聚集的能力依赖于其近膜区的酪氨酸磷酸化修饰，当特异性的抑制MuSK的这段近膜区的功能后，突触后膜失去了nAchRs表达和聚集的能力[23,24]。为了探讨nAchRs在口轮匝肌和腓肠肌运动终板处的表达差异的原因，根据以上我们对Mu SK在运动终板形成和成熟的中作用的认识，我们首先分析了口轮匝肌和腓肠肌运动终板的MuSK表达量，同时评估了Mu SK的磷酸化水平。结果显示了在两种肌肉运动终板处的Mu SK的表达水平没有差异，而MuSK的磷酸化水平有显著差异，提示MuSK在两种肌肉中被不同程度的激活。为了寻找MuSK磷酸化水平的差异的原因，我们探究了能促使MuSK发生磷酸化的上游因子的表达水平。在运动终板处，由运动神经元分泌的Agrin，是一种肝素硫酸酯类糖蛋白分子。Agrin通过与突触后膜Lrp4结合，激活MuSK近膜区的Y533位的酪氨酸发生磷酸化，促进MuSK对nAchR在突触后膜表达和聚集的作用，最终实现突触后膜nAchRs的表达和聚集[20,25,26]。失去Agrin和Lrp4的作用，突触后膜MuSK磷酸化的水平显著降低，而且突触后膜nAchRs的表达和聚集也被抑制[27]。鉴于Agrin和Lrp4对MuSK有激活的作用，我们检测了口轮匝肌和腓肠肌运动终板处的Agrin和Lrp4的表达。然而，我们并没有发现这两种蛋白在口轮匝肌和腓肠肌运动终板的表达有显著差异，这说明了口轮匝肌运动终板处MuSK相对高的磷酸化水平的原因并不是来自Agrin和Lrp4的表达。
【相似文献】
本文编号：2856881
【部分图文】：
利用免疫共沉淀技术，我们发现在100 kD条带的位置，MuSK在两种肌肉中的表达并无差异。然而通过计算4G10（磷酸化的MuSK）条带的强度与MuSK条带强度的比值，得出口轮匝肌中MuSK磷酸化程度高于腓肠肌中MuSK磷酸化水平(63.7%±2.26-45.3%±3.27,P<0.05,n=20)。结果见图1。2.2 口轮匝肌和腓肠肌中运动终板处Agrin、Lrp4和MuSK的表达比较
对腓肠肌和口轮匝肌运动终板处的Agrin,Lrp4和MuSK进行荧光染色。α-BTX（α-bungarotoxin）是一种银环蛇毒素，可以特异性结合nAchRs的α1亚基，用于标记运动终板。Agrin在口轮匝肌中运动终板的荧光密度(0.07959±0.005334)与腓肠肌(0.08235±0.004976)中差异无统计学意义(P>0.05,n=20),Lrp4(0.04213±0.002265-0.04122±0.002043)和MuSK(0.04829±0.002214-0.04267±0.002098)也无显著差异(P>0.05,n=20)，结果见图2。2.3 口轮匝肌和腓肠肌中运动终板处ErbB2,ErbB3和ErbB4的表达
在胚胎发育过程中，肌肉会预先选定运动终板位置，并引导神经末梢的的生长，最终形成完整的突触的结构，而表达于肌细胞膜上的MuSK蛋白在这一过程中起决定性的作用。在MuSK突变的的肌管和小鼠胚胎中，运动终板的突触前和突触后的的正常结构都无法形成。MuSK在体外培养的成肌细胞中以低水平表达，同时动物实验证明在胚胎早期，MuSK特异性表达于发育中的肌肉，但MuSK的水平在成熟肌肉中却显著下降，仅在神经肌肉接头处的表达和分布[20]。突触后膜nAchRs的形成和聚集是运动终板成熟的标志，这一过程和MuSK表达和被激活发生磷酸化息息相关[21,22]。在MuSK基因敲除小鼠或从突变体提取和培养的肌管中，nAChRs不能在运动终板处聚集，甚至失去了突触特异性nAChRs表达和转录能力。然而，MuSK对于n AChRs聚集的能力依赖于其近膜区的酪氨酸磷酸化修饰，当特异性的抑制MuSK的这段近膜区的功能后，突触后膜失去了nAchRs表达和聚集的能力[23,24]。为了探讨nAchRs在口轮匝肌和腓肠肌运动终板处的表达差异的原因，根据以上我们对Mu SK在运动终板形成和成熟的中作用的认识，我们首先分析了口轮匝肌和腓肠肌运动终板的MuSK表达量，同时评估了Mu SK的磷酸化水平。结果显示了在两种肌肉运动终板处的Mu SK的表达水平没有差异，而MuSK的磷酸化水平有显著差异，提示MuSK在两种肌肉中被不同程度的激活。为了寻找MuSK磷酸化水平的差异的原因，我们探究了能促使MuSK发生磷酸化的上游因子的表达水平。在运动终板处，由运动神经元分泌的Agrin，是一种肝素硫酸酯类糖蛋白分子。Agrin通过与突触后膜Lrp4结合，激活MuSK近膜区的Y533位的酪氨酸发生磷酸化，促进MuSK对nAchR在突触后膜表达和聚集的作用，最终实现突触后膜nAchRs的表达和聚集[20,25,26]。失去Agrin和Lrp4的作用，突触后膜MuSK磷酸化的水平显著降低，而且突触后膜nAchRs的表达和聚集也被抑制[27]。鉴于Agrin和Lrp4对MuSK有激活的作用，我们检测了口轮匝肌和腓肠肌运动终板处的Agrin和Lrp4的表达。然而，我们并没有发现这两种蛋白在口轮匝肌和腓肠肌运动终板的表达有显著差异，这说明了口轮匝肌运动终板处MuSK相对高的磷酸化水平的原因并不是来自Agrin和Lrp4的表达。
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