恶性疟原虫表观遗传修饰对var基因转录调控的研究

发布时间：2020-10-27 00:00

　　 恶性疟原虫表面蛋白1（Plasmodium falciparum erythrocyte membraneprotein1，PfEMP1），是目前研究最为广泛的恶性疟原虫毒力因子之一，疟原虫进入人体红细胞后，PfEMP1被置于红细胞表面，改变红细胞骨架及细胞膜表面结构，不同型PfEMP1具有与不同血管内皮受体（如ICAM-1，CSA和CD36等）相结合的能力，因此感染疟原虫的红细胞在不同组织的血管内聚集，从而逃避了人体脾脏的杀伤作用，同时PfEMP1的多变性表达使得虫体能够逃避特异性免疫产生的抗体的杀伤和清除，因而恶性疟原虫可以长期在宿主体内寄生和繁殖。编码PfEMP1的var基因家族一直是人们研究的重点。var基因家族共有60个家族成员，然而1个疟原虫每个生命周期只表达1个var基因，其余59个var基因均处于转录沉默状态，这种转录表达的方式叫做互斥表达（mutuallyexclusive gene expression），是疟原虫为了逃避宿主免疫系统的抗原变异机制之一。 表观遗传机制对互斥表达进行调控，组蛋白赖氨酸甲基化酶SET2能够三甲基化H3K36，形成的H3K36me3是var基因沉默的重要表观遗传标记。SET2上的SRI区域能够特异性的与RNA pol II CTD区域的特异性结合从而使SET2发挥修饰H3K36的作用。 本试验首先构建能够表达SRI的重组质粒，转染恶性疟原虫3D7株，转染成功后的重组质粒表达的SRI与RNA pol II CTD结合，通过提高筛选药物的浓度，增加外源SRI的表达量，使内源SET2与RNA pol II CTD的正常结合受抑制，最终导致H3K36me3减少，这一方法称为SET2的显性负载体的建立。上述试验成功后，对var基因转录情况进行观察发现，原var基因转录量显著下调甚至被取代，而编码妊娠相关性疟疾PfEMP1的var2csa基因被转录激活。同时，大量恶性疟原虫研究表明H3K9me3与H3K36me3共同标记沉默的var基因，因此对H3K9甲基化酶进行抑制剂也会建立相同的表型。因此我们对包括H3K9甲基化酶抑制剂在内的一组组蛋白修饰酶抑制剂进行了考察。我们成功地观察到在300nM的Chaetocin的作用下，两株疟原虫均表现出了与前述PfSET2功能下调实验所产生的var基因转录变化相同的表型，即原本唯一转录的var基因转录量显著下调，var2csa基因被激活转录，并且这种var基因的转录转换随着Chaetocin的浓度加大或者处理时间延长而越发显著。 结合先前文献报道的对SET2进行基因敲除后，全部60个var基因均转录表达的结果，也就是说当SET2功能下调时，原始唯一转录的var基因转录量显著下调，var2csa基因被激活转录；当SET2功能完全丧失时，所有var基因同时转录表达，以上说明在var基因家族成员进行的转录转换过程中，存在一个顺序先后，根据我们的实验结果显示var2csa基因则是在这个顺序的最优位置。同时，我们还对另一地理株HB3进行了相同的实验，得到了与3D7株一致的结果。 1个疟原虫在每个生活周期只转录表达1个var基因，通常一个var基因连续表达若干代，然后转换至表达另一个var基因，实验及数学模型计算证明，这样的var基因家族成员之间的转换表达并非随机发生，而是遵循一定的顺序，然而目前尚无对于这一顺序的阐述和诠释的报道。在上述观察到的var2csa基因从沉默转变为激活状态，这是单纯的var2csa基因的转录激活，还是这其中涉及到了var基因的转录转换的顺序过程呢？为了探索这一问题，我们利用恶性疟原虫DC-J株进行了不同方式的Chaetocin药物抑制实验，进一步确立了var2csa基因作为var基因转录转化顺序中的“转换中介”作用，即所有var基因在开始转录下一个var基因前，都要先转录var2csa基因，然后以该基因为起点，转至转录下一个var基因，开始新的转录表达。这是疟疾研究领域对该问题的首次报道。 本实验的最后部分对var基因的非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）的转录机制进行了初步探索。var基因有一长一短两个外显子，处在两外显子之间的内含子具有启动子的功能，可以从正义和反义两个方向转录非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）。然而，对恶性疟原虫var基因内含子转录活性的研究一直以来存在一个障碍，即var内含子在疟原虫染色体环境之外的核酸环境中，其转录ncRNA的活性丧失，变为一个双向转录mRNA的启动子，这样就对ncRNA的研究产生很大困难，同时这个问题本身亦是一个非常值得研究的科学问题，因此本试验通过最大程度的模拟var基因内含子所处的核酸环境来构建重组质粒，考察荧光素酶信号来判定我们是否成功构建了含有转录ncRNA的内含子启动子的重组质粒。我们成功构建了10种重组质粒，排除了多个可能存在影响var基因内含子启动子性质的核酸元件所在的染色体位置，为日后的研究提供了参考。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2014
【中图分类】：R382.31
【部分图文】：

图 1.1 var 基因的基因组结构及位置分布 .1 G e n o mi c o r ga ni z a t i on a n d nu c l e a r pos i t i on o f v ar 性疟原虫染色体亚端粒区通常分布指向染色体中部的 UpsB 组 var 基因，相反 UpsA组和/或 UpsC 组 var 基因, rif 和 stevor 基因家族通常位于亚端粒区的因家族之间，染色体中部则较为集中分布 UpsC组 var 基因。常 4-7 个恶性疟原虫的染色体在端粒部位聚在一起，形quets）这种结构，该结构使得位于亚端粒区的、具有相似 5′端序列 var 基因彼此粘连导致交换重组的发生[5]。另外，由于许多 rif 基psA 组 var 基因的 5′端相邻，且相邻区域两基因的启动子彼此间序因此推测这种 5′端序列之间交换重组可能也同样发生在 rif 多基因因家族之间[10, 11]。位于亚端粒区的 UpsB 组与位于染色体中部的 组，尚不清楚。但是原本应该位于染色体中部的 UpsC 组 var 基因

图 1.2 var 基因家族间重组模型[9]Fig.1.2 Model of recombination among var genes簇”的端粒区及中部的异位重组通常发生在具有相似 Ups 序列，相同转录染色体位置的 var基因之间，在减数分裂及有丝分裂过程中都可能发生。与其它组不同，主要进行本组之间的重组。var 基因与相邻的 rif 基因家族组，但是未见与 stevors 有此种重组发生。性疟原虫 var 基因家族编码的恶性疟原虫表面蛋白 1其多样的 var 基因家族编码的恶性疟原虫表面蛋白 1（Plum erythrocyte membrane protein 1，PfEMP1），是研究最为深入力因子。疟原虫进入寄生红细胞后，将 PfEMP1 置于红细胞表骨架和细胞膜表面结构，不同型 PfEMP1 具有与结合不同血管的能力，如 ICAM-1，CSA 和 CD36 等，因此感染疟原虫的红

图 1.3 var 基因家族间重组模型[14]Fig.1.3 The variant antigen family of PfEMP1 is central tohost-parasinteraction and pathogenesis.恶性疟原虫感染的成熟人红细胞表面表达不同抗原表型且可结合不同毛细PfEMP1。聚集在脑部和胎盘毛细血管的感染红细胞引起脑型疟和妊娠相关性受体的结合，感染红细胞之间通过血小板的聚集（clumping）以及感染的红红细胞之间的聚集以及感染红细胞与树突状巨噬细胞的结合抑制宿主免疫应成疟疾的发生。hyaluronic acid），透明质酸；TSP（thrombospondin），血栓黏合素;-1（endothelial/leukocyte adhesion molecule 1），内皮细胞/白细胞黏附分子 1；P-selectin），血小板选择蛋白；-1（vascular cell adhesion molecule 1），血管细胞黏附分子 1；M(CD31，platelet endothelial cell adhesion molecule1),小板内皮细胞黏附分子 1；
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本文编号：2857714