一种高亲和结合Ⅰ型胶原蛋白的GST融合蛋白表达分析

发布时间：2020-10-26 23:07

　　 鉴于纤维化疾病病人组织中Ⅰ型胶原的异常沉积和人胎盘生长因子2氨基酸123～144肽段(PlGF-2_(123-144))对Ⅰ型胶原蛋白出众的高亲性,尝试制备PlGF-2_(123-144)短肽用于改善抗纤维化药物的组织靶向特异性。首先对该短肽的编码DNA序列进行修改和扩增,构建了GST-PlGF-2_(123-144)融合蛋白的原核表达质粒;进而使用E.coli BL21诱导表达该融合蛋白,并以谷胱甘肽琼脂糖纯化后透析;最后采用ELISA检测确定,经原核表达和纯化所获得的GST-PlGF-2_(123-14)融合蛋白具备对Ⅰ型胶原蛋白的高亲性。为研发特异性靶向纤维化组织的抗纤维化药物打下了可靠基础。
【部分图文】：

液进行透析并以BCA方法定量。1．2．4融合蛋白对I型胶原蛋白的亲和活性的ELISA实验测定按照图1所示流程进行ELISA实验。ELISA孔板首先用100μLI型胶原蛋白包埋4℃过夜、干燥过夜，随后脱脂牛奶进行封闭。孔板漂洗后再分别加入GST融合蛋白和胶原蛋白共孵育。漂洗后加入GST一抗(1∶5000)4℃孵育过夜检测滞留的GST蛋白。二抗孵育后，加入0.3%H2O2甲醇溶液封闭、进行常规显色。读取各孔450nm处OD值并计算GST信号。图1ELISA实验流程示意图Figure1ELISAexperimentalflowdiagram1．2．5统计学分析实验数据均以平均值±标准差(x±s)表示。采用TTEST检验方法比较同等摩尔数的GST和GST-PlGF－2123－144蛋白的组间差异，P＜0.05表示组间有显著性差异。2结果与分析2.1PlGF－2123－144基因片段的获得采用各含部分PlGF－2123－144DNA序列的两段引物进行退火和PCＲ扩增，获得含PlGF－2123－144序列的扩增产物(图2－A);随后与pMD19－T载体连接，转化E．coliDH5α感受态细胞。挑选白色菌落进行菌落PCＲ，2%琼脂糖凝胶电泳显示100bp处有一条特异性条带，与PlGF－2123－144(88bp)片段大小基本相符(图2－B)。提取阳性细菌质粒，使用HindⅢ进行单酶切。图2－C的0.8%琼脂糖电泳结果显示，1泳道1.9kb的未线性化质粒在单酶切后产生约2.7kb的片段，和pMD19－PlGF－2123－1442770bp的大小符合(2号泳道)。测序结果显示PlGF－2123－144目的DNA序列成功克隆到pMD19质粒(图2－D)

?ń峁?EcoＲI单酶切产生的约5kb单一片段在结合EcoＲV进行双酶切后，可被断裂为2和3kb大小的两个片段，表明两种pGEX4T1质粒均被成功导入E．coliBL21。A:PlGF－2123－144序列的PCＲ扩增;B:pMD19－PlGF－2123－144菌落PCＲ;C:pMD19－PlGF－2123－144质粒单酶切;D:pMD19－PlGF－2123－144测序图2pMD19－PlGF－2123－144质粒构建和鉴定Figure2ConstructionandcharacterizationofpMD19－PlGF－2123－144plasmidA:菌落PCＲ;B:测序结果;C:pGEX－4T－1转化BL21酶切结果;D:pGEX4T1－PlGF－2123－144转化BL21酶切鉴定结果图3重组质粒pGEX4T1－PlGF－2123－144质粒鉴定和转化BL21鉴定结果Figure3IdentificationandtransformationofBL21byrecombinantplasmidpGEX4T1－PlGF－2123－1442.3GST和GST-PlGF－2123－144蛋白的诱导表达以30℃为诱导温度，探索IPTG诱导浓度(0.1～4mmol/L)和诱导时间(1～4h)对两种GST蛋白诱导表达的影响。如图4－A所示，1mmol/LIPTG诱导6h后，GST的蛋白产量和在细菌裂解上清中的所占比例都已达到较好水平。图4－B的WesternBlot分析结果则显示了GST-PlGF－2123－144蛋白在不同条件下都有较好的诱导表达。进一步对目的蛋白阳性条带进行光密度扫描定量分析，发现1mmol/LIPTG时，不同诱导时间样品的光密度分别为3734.95、5358.32、7231.04和7681.65，说明蛋白产量随诱导时间延长而增多。当设定诱导时间6h，不同IPTG浓度下样品的光密度分别为8895.96、7990.42、7681.65、6246.76和8078.7

l/LIPTG和6h的诱导条件下，可溶性GST-PlGF－2123－144蛋白产量可达最高。通过对细菌总蛋白进行考马斯亮蓝染色，我们比较了GST和GST-PlGF－2123－144融合蛋白表达产量。图5－B为来自相同诱导培养条件(1mmol/LIPTG，6h)下等量菌液中两种蛋白的表达结果。占细菌总蛋白41%的是GST蛋白，GST-PlGF－2123－144蛋白所占比例有所下降，约为34%;而GST-PlGF－2123－144蛋白表达量约为GST蛋白的83%。A:GST蛋白;B:GST-PlGF－2123－144蛋白图4GST和GST-PlGF－2123－144蛋白的最适诱导表达条件的WesternBlot分析Figure4WesternBlotassayforoptimizationoftheinducedGSTandGST-PlGF－2123－144proteins2.4GST和GST-PlGF－2123－144蛋白的纯化大量诱导表达GST和GST-PlGF－2123－144蛋白后，采用GlutathioneSepharose4B亲和性胶泥纯化可溶性目的蛋白，并在每个纯化步骤完成后取少量样品、进行了SDS-PAGE和WesternBlot分析。图5考马斯亮蓝染色定量分析，GST洗脱液的纯度分别为96%、98%和99%。GST-PlGF－2123－144的纯度从72%、86%到97%。WesternBlot结果显示，胶泥亲和吸附的GST蛋白在332第36卷第5期2019年10月生物学杂志JOUＲNALOFBIOLOGYVol.36No.5Oct.2019???????????????????????????????????????????????
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