鼠抗人PD-1单克隆抗体研制及其生物学功能鉴定
发布时间：2020-10-27 12:08
PD-1分子属免疫球蛋白超家族成员,人PD-1分子为含有288个氨基酸的I型跨膜糖蛋白。PD-1主要表达于活化的T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞等。PD-1与其配体PD-L1、PD-L2相结合,发挥负性调控作用,参与维持机体免疫稳态。PD-1/PD-Ls免疫调节功能异常参与了自身免疫疾病和肿瘤等的重要病理机制。本文主要研制鼠抗人PD-1单克隆抗体,对其生物学功能进行鉴定,以期为PD-1/PD-Ls途径的研究提供研究工具和实验依据。第一部分构建人PD-1基因转染细胞株目的:构建人PD-1基因转染细胞株,以用于PD-1单克隆抗体的研制。方法:将重组逆转录病毒表达载体p EGZ-term-R/PD-1以脂质体转染法转染293T细胞,收集具有感染能力的病毒上清,感染L929细胞,经G418筛选后,采用流式细胞术和Western Blot方法鉴定该细胞株PD-1分子的表达。结果:获得一株稳定表达人PD-1分子的基因转染细胞株L929/PD-1。结论:成功构建稳定表达人PD-1分子的基因转染细胞株,为研制PD-1单克隆抗体提供免疫原。第二部分鼠抗人PD-1单克隆抗体制备及鉴定目的:研制PD-1单克隆抗体为探讨PD-1/PD-Ls途径建立研究工具。方法:采用稳定表达人PD-1基因转染细胞株L929/PD-1,免疫BALB/c小鼠,采用常规B淋巴杂交瘤技术,经HAT培养筛选、间接免疫荧光分析,获得一株持续稳定分泌鼠抗人PD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株15D9;采用快速定性试纸法鉴定单克隆抗体类型;利用流式细胞术检测竞争结合位点、抗体效价;采用细胞免疫化学实验鉴定15D9对PD-1分子的识别。结果:获得一株稳定分泌抗人PD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为15D9;15D9重链为Ig G1,轻链为κ链;竞争结合实验结果显示单抗15D9与单抗6E1识别相似位点;抗体效价结果显示,0.3μg/test可用于间标流式细胞术检测,1μg/test可用于直标流式细胞术检测;细胞免疫化学实验结果显示,15D9可特异性识别PD-1分子。结论:成功获得一株稳定分泌抗人PD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株15D9,可用于免疫荧光标记、流式细胞术和免疫组化实验。第三部分鼠抗人PD-1单克隆抗体的阻断功能鉴定目的:通过观察单抗15D9在PBMC活化过程中的作用,初步鉴定单抗15D9的生物学功能。方法:采用激发型CD3单克隆抗体包被,联合激发型CD28单克隆抗体活化PBMC,于24 h、48 h、72 h检测PD-1和PD-L1分子的表达。加入单抗15D9后,观察PBMC的形态变化,细胞计数法检测PBMC数量变化。采用流式细胞术检测CD69、CD25在24 h、48 h和72 h的表达水平。采用ELISA检测在96 h时IL-2和IFN-γ的分泌量。结果:激发型CD3单克隆抗体联合激发型CD28单克隆抗体活化PBMC后,PBMC表达PD-1和PD-L1分子。加入单抗15D9后,CD3+CD28+15D9组与CD3+CD28+Ig G组相比,PBMC集落直径增大、集落数量增多,PBMC的CD69、CD25表达增高,分泌的IFN-γ升高。结论:激发型CD3单克隆抗体联合激发型CD28单克隆抗体可活化PBMC,加入单抗15D9后PBMC活化程度增强,表明15D9是一株具有阻断功能的单克隆抗体。
【学位单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R392
【部分图文】：
图 1 B7-CD28 家族共抑制信号(引自 Immunity, 2016, 44(5): 955-972)分子结构及表达谱 B7-DC 或 CD273，Tseng 和同事于 2002 年从 DC的基因文库中鉴定了 B7-DC。小鼠 PD-L2（mPD-L 247 个氨基酸的前体蛋白，具有 23 个 氨基酸的 NmB7-DC 与人 B7-DC（hB7-DC）具有 70％的同源处在于它具有较长的胞质尾巴。hPD-L2 基因位于 9，但细胞质区较短。采用同源性检索的方法，发现性（34％同一性，48％相似性）[21]。达谱较 PD-L1 窄，仅表达于 DCs 以及活化的巨噬细和培养的骨髓来源的肥大细胞[21-22]。在与 PD-1 结
图 2 肿瘤微环境中免疫系统调节途径(引自 Nat Immunol. 2013, 14(10): 1014–1022)PD-L1、PD-L2 途径与肿瘤免疫治疗常涉及多种抵抗机制，可以逃逸宿主肿瘤免疫系统免疫卡控点抑制剂显著增强抗肿瘤免疫性。免疫卡控cular）是免疫系统中的多种激活和抑制途径，其对维理学免疫应答的持续时间和幅度至关重要。CTLA-4从而引发免疫应答，是第一个经临床验证的免疫卡控的相互作用可以增强抗肿瘤反应，延缓肿瘤生长，并卡控点促进肿瘤细胞破坏是癌症免疫治疗的重要策和 Pembrolizumab 分别是人的和完全人源化的 IgG4 P断 PD-1 并通过消除 PD-1 介导的 T 细胞抑制来促进
图 2 Western Blot 鉴定 L929/PD-1 细胞 PD-1 的表达2：抗原为 L929 细胞裂解蛋白；3：抗原为 L929/M胞裂解蛋白讨 论径在机体免疫调控中发挥重要作用。PD-1 与配递负信号，其负性调节细胞因子分泌并促进 T染细胞株可应用于 PD-1 生物学功能研究，也开展 PD-1/PD-Ls 途径的研究工作提供研究工具立了人 PD-1 基因转染细胞株 L929/PD-1。首先-Term-R重组逆转录病毒载体，以及辅助病毒p转染 293T 细胞。为了提高转染效率，在转染过素，包括转染细胞的生长状态、DNA 复合物与
【参考文献】
本文编号：2858503
【学位单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R392
【部分图文】：
图 1 B7-CD28 家族共抑制信号(引自 Immunity, 2016, 44(5): 955-972)分子结构及表达谱 B7-DC 或 CD273，Tseng 和同事于 2002 年从 DC的基因文库中鉴定了 B7-DC。小鼠 PD-L2（mPD-L 247 个氨基酸的前体蛋白，具有 23 个 氨基酸的 NmB7-DC 与人 B7-DC（hB7-DC）具有 70％的同源处在于它具有较长的胞质尾巴。hPD-L2 基因位于 9，但细胞质区较短。采用同源性检索的方法，发现性（34％同一性，48％相似性）[21]。达谱较 PD-L1 窄，仅表达于 DCs 以及活化的巨噬细和培养的骨髓来源的肥大细胞[21-22]。在与 PD-1 结
图 2 肿瘤微环境中免疫系统调节途径(引自 Nat Immunol. 2013, 14(10): 1014–1022)PD-L1、PD-L2 途径与肿瘤免疫治疗常涉及多种抵抗机制，可以逃逸宿主肿瘤免疫系统免疫卡控点抑制剂显著增强抗肿瘤免疫性。免疫卡控cular）是免疫系统中的多种激活和抑制途径，其对维理学免疫应答的持续时间和幅度至关重要。CTLA-4从而引发免疫应答，是第一个经临床验证的免疫卡控的相互作用可以增强抗肿瘤反应，延缓肿瘤生长，并卡控点促进肿瘤细胞破坏是癌症免疫治疗的重要策和 Pembrolizumab 分别是人的和完全人源化的 IgG4 P断 PD-1 并通过消除 PD-1 介导的 T 细胞抑制来促进
图 2 Western Blot 鉴定 L929/PD-1 细胞 PD-1 的表达2：抗原为 L929 细胞裂解蛋白；3：抗原为 L929/M胞裂解蛋白讨 论径在机体免疫调控中发挥重要作用。PD-1 与配递负信号，其负性调节细胞因子分泌并促进 T染细胞株可应用于 PD-1 生物学功能研究，也开展 PD-1/PD-Ls 途径的研究工作提供研究工具立了人 PD-1 基因转染细胞株 L929/PD-1。首先-Term-R重组逆转录病毒载体，以及辅助病毒p转染 293T 细胞。为了提高转染效率，在转染过素，包括转染细胞的生长状态、DNA 复合物与
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 骆群;吕明;于鸣;黎燕;;抗CD28抗体协同刺激增强抗CD3抗体体外激活T淋巴细胞并降低TGF-β的表达[J];中国实验血液学杂志;2006年03期
本文编号：2858503
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