CA16病毒抗原与呼吸道黏膜上皮组织内ILCs的相互关系及其作为疫苗应用的免疫学分析
发布时间：2020-10-28 01:30
柯萨奇病毒A组16型(Coxackievirustype A 16,CA16)是肠道病毒属小RNA病毒科的一员,CA16与肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)是引起手足口病(Hand Foot and Mouth Disease,HFMD)的主要病原体。随着EV71预防性疫苗的上市使用,CA16无疑成为了引起HFMD的另一重要病原体。然而,由于CA16的发病机制及其相关的免疫反应尚不清楚,CA]6疫苗的开发工作面临着诸多困难。先前的研究已经表明呼吸道黏膜上皮细胞及其相关的免疫细胞,尤其是固有淋巴细胞(Innate lymphoid cells,ILCs),在很大程度上促进了病毒感染过程中固有免疫和适应性免疫反应的激活。而ILCs是否在CA16感染引起的免疫反应中发挥类似的作用目前尚未可知。在本研究中,为了揭示ILCs在CA16感染中的作用,我们首先用CA16感染体外培养的人支气管上皮细胞16HBE,并对其在感染16HBE细胞过程中与ILCs激活相关的多个信号通路分子的基因表达水平做了 Q-RT-PCR检测。结果显示了 CA16感染16HBE细胞时干扰素-肿瘤坏死因子家族信号分子的上调特征。随后我们使用以油/水乳剂型乳剂配制的CA16灭活抗原与小鼠支气管上皮细胞CP-M175共孵育,并继续观察导入CA16抗原后该细胞中天然免疫信号分子的表达变化情况,结果显示以干扰素-肿瘤坏死因子家族为中心的信号反应网络的变化趋势与该病毒感染16HBE细胞类似。进一步的,我们利用这种CA16灭活疫苗通过鼻腔滴入免疫Balb/c小鼠,并分析了在呼吸道黏膜组织中ILCs与病毒抗原之间的相互关系。CA16活病毒和灭活的病毒颗粒在体内和体外都能诱导ILCs活化所需要的各种信号通路分子的上调表达。此外,免疫荧光和共聚焦的观察结果还发现病毒抗原与表达GATA-3/NKp46的ILC1和表达RORγt/GATA-3的ILC3存在共定位现象,而表达KLRG-1/GATA-3的ILC2却没有检测到。与此同时,我们还观察到了 CA16抗原和CD 11 c+DCs的共定位现象。随后,我们检测了不同免疫途径的小鼠体内抗CA16中和抗体和特异性细胞免疫应答情况。所有的结果都提示以特别配制的CA16灭活疫苗通过鼻腔途径免疫小鼠后能诱导小鼠产生较好的抗病毒免疫应答。在本文的工作中,我们首先在体外组织培养体系中验证了 CA16与ILCs的相互作用关系。同时,通过利用Balb/c小鼠模型,我们进一步分析了 CA16抗原经鼻腔免疫动物后,其在体内与ILCs的相互关系,以及由此诱发的机体特异性免疫反应的过程。本文的工作为进一步探索基于病毒感染模型而设计相应疫苗免疫模式的可能提供了理论基础。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R392
【部分图文】：
图３：天然淋巴细胞在屏障表面的保护作用［４７］??内的抗病毒免疫应答不仅受ＤＣ细胞，巨噬细胞，Ｔ细胞和Ｂ细胞的受其他细胞的调节，如ＮＫ细胞和ＮＫＴ细胞。因此，充分了解体内免的相互作用对于了解体内抗病毒免疫应答是很重要的。对于抗病毒免
将病毒液收获后储存于－８０°Ｃ，进行病毒感染性滴度的测定。结果表明，随着时间的??增加，１６ＨＢＥ细胞形态逐渐肿胀变圆，细胞间隙逐渐增大，２４ｈ时约有５０％的细胞??出现细胞病变效应，４８ｈ时已有接近１００％的细胞出现了细胞病变效应，如图１所示。??Ｃｏｎｔｒｏｌ?８ｈ?１６ｈ??■｜｜?ＩＩ?｜??２４ｈ?３２ｈ?４８ｈ??■■■■■?■■■■?■■■■ｉ??图１：人呼吸道上皮细胞１６ＨＢＥ感染ＣＡ１６病毒后细胞形态的变化。??２．１．２?ＣＡ１６感染１６ＨＢＥ细胞后增殖动力学检测??以ＭＯＩ＝０．１的ＣＡ１６病毒液感染１６ＨＢＥ细胞后在３７°Ｃ下培养的条件下，在感??染后８ｈ、１６ｈ、２４ｈ、３２ｈ、４０ｈ以及４８ｈ收取病毒样品，采用５０％终点测定法测定??各个时间点的病毒滴度，并绘制增殖动力学曲线。从绘制出来的增殖曲线可以看出??２７??
?当ＣＡ１６病毒感染１６ＨＢＥ细胞２４小时到３２小时之间时滴度达到峰值，而随着时间??的增加病毒液滴度开始降低，如图２所示。??曹?６．５?■??卜一??５．５?■??二??＾?５．０?Ｊ——，——，——，——，——，——．??０?８?１６?２４?３２?４０?４８??Ｈｏｕｒｓ?ｐｏｓｔ?ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ??图２：?ＣＡ１６病毒在１６ＨＢＥ细胞上的增殖动力学曲线。??２．１．３?ＣＡ１６感染１６ＨＢＥ细胞后ＩＬＣｓ激活相关的信号通路分子变化??模式识别受体（ＰＲＲ）主要表达于固有免疫细胞表面，可以识别一种或多种??ＰＡＭＰ?（病原体相关分子模式）／ＤＡＭＰ?（损伤相关分子模式）。根据ＰＲＲ的功能可??以把ＰＲＲ主要分为可溶型ＰＲＲ，细胞吞噬型ＰＲＲ和信号转导型ＰＲＲ。信号传导型??ＰＲＲ通过与ＰＡＭＰ／ＤＡＭＰ结合后
【参考文献】
本文编号：2859362
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R392
【部分图文】：
图３：天然淋巴细胞在屏障表面的保护作用［４７］??内的抗病毒免疫应答不仅受ＤＣ细胞，巨噬细胞，Ｔ细胞和Ｂ细胞的受其他细胞的调节，如ＮＫ细胞和ＮＫＴ细胞。因此，充分了解体内免的相互作用对于了解体内抗病毒免疫应答是很重要的。对于抗病毒免
将病毒液收获后储存于－８０°Ｃ，进行病毒感染性滴度的测定。结果表明，随着时间的??增加，１６ＨＢＥ细胞形态逐渐肿胀变圆，细胞间隙逐渐增大，２４ｈ时约有５０％的细胞??出现细胞病变效应，４８ｈ时已有接近１００％的细胞出现了细胞病变效应，如图１所示。??Ｃｏｎｔｒｏｌ?８ｈ?１６ｈ??■｜｜?ＩＩ?｜??２４ｈ?３２ｈ?４８ｈ??■■■■■?■■■■?■■■■ｉ??图１：人呼吸道上皮细胞１６ＨＢＥ感染ＣＡ１６病毒后细胞形态的变化。??２．１．２?ＣＡ１６感染１６ＨＢＥ细胞后增殖动力学检测??以ＭＯＩ＝０．１的ＣＡ１６病毒液感染１６ＨＢＥ细胞后在３７°Ｃ下培养的条件下，在感??染后８ｈ、１６ｈ、２４ｈ、３２ｈ、４０ｈ以及４８ｈ收取病毒样品，采用５０％终点测定法测定??各个时间点的病毒滴度，并绘制增殖动力学曲线。从绘制出来的增殖曲线可以看出??２７??
?当ＣＡ１６病毒感染１６ＨＢＥ细胞２４小时到３２小时之间时滴度达到峰值，而随着时间??的增加病毒液滴度开始降低，如图２所示。??曹?６．５?■??卜一??５．５?■??二??＾?５．０?Ｊ——，——，——，——，——，——．??０?８?１６?２４?３２?４０?４８??Ｈｏｕｒｓ?ｐｏｓｔ?ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ??图２：?ＣＡ１６病毒在１６ＨＢＥ细胞上的增殖动力学曲线。??２．１．３?ＣＡ１６感染１６ＨＢＥ细胞后ＩＬＣｓ激活相关的信号通路分子变化??模式识别受体（ＰＲＲ）主要表达于固有免疫细胞表面，可以识别一种或多种??ＰＡＭＰ?（病原体相关分子模式）／ＤＡＭＰ?（损伤相关分子模式）。根据ＰＲＲ的功能可??以把ＰＲＲ主要分为可溶型ＰＲＲ，细胞吞噬型ＰＲＲ和信号转导型ＰＲＲ。信号传导型??ＰＲＲ通过与ＰＡＭＰ／ＤＡＭＰ结合后
【参考文献】
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本文编号：2859362
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