铜绿假单胞菌噬菌体的分离、鉴定及其对生物被膜作用的研究

发布时间：2020-10-28 02:10

　　 铜绿假单胞菌是一种环境中广泛分布的条件致病菌,因抗生素滥用,该菌已成为最严重耐药菌之一。铜绿假单胞菌较强的生物被膜形成能力是其产生耐药性的重要原因,目前急需寻找新方法来解决铜绿假单胞菌耐药性问题。噬菌体因其能特异性感染并裂解宿主菌,和安全、高效、研发周期短的特点得到了研究者们的重视。本研究以多重耐药性铜绿假单胞菌为宿主,筛选其裂解性噬菌体并考察其中一株噬菌体对多重耐药性铜绿假单胞菌生物被膜的防控效果。主要工作内容如下:(1)以多重耐药性铜绿假单胞菌为宿主,分离获得三株铜绿假单胞菌裂解性噬菌体分别命名为G1,LS1和C1,透射电镜观察三株噬菌体都为有尾目噬菌体,G1和LS1属于肌尾科噬菌体,C1属于长尾科噬菌体;噬菌体G1潜伏期为20 min,裂解量为230PFU/infected cell,噬菌体LS1和C1的潜伏期约30 min,裂解量分别为77 PFU/infected cell和86 PFU/infected cell;噬菌体G1的pH耐受性范围较宽,为4.0~11.0,LS1在pH值耐受范围为5.0~9.0,C1的pH值耐受范围为6.0~10.0;(2)全基因组测序结果显示三株噬菌体基因组均为双链线性DNA,噬菌体G1基因组大小为87,646 bp,G+C含量为54.7%,有156个基因,其中26个为已知功能基因,含有3个tRNA基因;噬菌体LS1基因组大小为66,093 bp,G+C含量为55.7%,有92个基因,其中35个为已知功能基因;噬菌体C1基因组大小为43,133 bp,G+C含量为53.6%,有59个基因,其中27个为已知功能基因;三株噬菌体都未发现整合酶,毒力因子和抗生素抗性基因;(3)根据噬菌体的宿主谱分析,首先考察噬菌体LS1的生物被膜防控能力。为考察噬菌体LS1对多重耐药性铜绿假单胞菌生物被膜的作用效果,分别用结晶紫染色、活菌计数和扫描电子显微镜法评价噬菌体的作用效果。活菌计数结果显示,噬菌体LS1可以抑制99%的铜绿假单胞菌生物被膜菌生长,能够清除85%的生物被膜菌;扫描显微镜观察结果同样显示噬菌体LS1能清除已形成的铜绿假单胞菌生物被膜;生物被膜菌对噬菌体抗性评价结果显示,噬菌体与生物被膜菌相互作用时,在24 h时会出现对噬菌体LS1抗性菌株。
【学位单位】：大连理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R378
【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
1 文献综述
    1.1 铜绿假单胞菌简介
        1.1.1 铜绿假单胞菌生物学特性和致病性
        1.1.2 铜绿假单胞菌的耐药性
    1.2 细菌生物被膜
        1.2.1 生物被膜的概念和构成
        1.2.2 生物被膜的生物学意义及其危害
        1.2.3 生物被膜的破除方法
    1.3 噬菌体去除生物被膜理论
        1.3.1 噬菌体简介
        1.3.2 目前噬菌体裂解细菌生物被膜理论
    1.4 噬菌体去除生物被膜的应用研究
        1.4.1 噬菌体去除临床病原菌生物被膜的研究
        1.4.2 防控食品工业生产中生物被膜的研究
        1.4.3 噬菌体清除污水处理厂滤膜生物淤积的研究
    1.5 本论文研究意义
    1.6 本论文研究思路
2 铜绿假单胞菌噬菌体的分离和生物学特性研究
    2.1 引言
    2.2 实验用品
        2.2.1 实验菌种
        2.2.2 引物合成
        2.2.3 主要实验试剂
        2.2.4 实验仪器
        2.2.5 实验溶液的配制
    2.3 实验方法
        2.3.1 铜绿假单胞菌的分子生物学鉴定
        2.3.2 噬菌体的分离纯化
        2.3.3 噬菌体最佳感染复数测定
        2.3.4 噬菌体宿主谱分析
        2.3.5 噬菌体一步生长曲线及裂解量测定
        2.3.6 噬菌体温度和pH稳定性测定
    2.4 结果与分析
        2.4.1 铜绿假单胞菌的分子生物学鉴定
        2.4.2 噬菌体分离纯化
        2.4.3 噬菌体透射电镜观察
        2.4.4 噬菌体最佳感染复数测定
        2.4.5 噬菌体宿主谱分析
        2.4.6 噬菌体一步生长曲线及裂解量测定
        2.4.7 噬菌体温度和pH稳定性测定
    2.5 讨论
    2.6 小结
3 铜绿假单胞菌噬菌体基因组学研究
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 实验样品
        3.2.2 分析软件
        3.2.3 实验试剂
    3.3 实验方法
        3.3.1 噬菌体基因组核酸的提取和测序
        3.3.2 噬菌体基因组基因预测及功能注释
        3.3.3 噬菌体的进化关系与基因组共线性分析
    3.4 结果与分析
        3.4.1 噬菌体基因组的提取和测序
        3.4.2 噬菌体基因组基因预测与功能注释
        3.4.3 噬菌体的进化关系与基因组共线性分析
    3.5 讨论
    3.6 小结
4 噬菌体LS1对多重耐药铜绿假单胞菌生物被膜的作用研究
    4.1 引言
    4.2 实验材料
        4.2.1 实验样品
        4.2.2 实验试剂与材料
        4.2.3 实验仪器与溶液配制
    4.3 实验方法
        4.3.1 铜绿假单胞菌生物被膜形成周期测定
        4.3.2 不同铜绿假单胞菌株生物被膜形成能力测定
        4.3.3 噬菌体LS1对铜绿假单胞菌生物被膜作用研究
        4.3.4 生物被膜菌对噬菌体抗性评价
        4.3.5 统计学分析
    4.4 结果与分析
        4.4.1 铜绿假单胞菌生物被膜形成周期
        4.4.2 铜绿假单胞菌生物被膜形成能力研究
        4.4.3 噬菌体对铜绿假单胞菌生物被膜作用研究
        4.4.4 生物被膜菌对噬菌体抗性评价
    4.5 讨论
    4.6 小结
结论
展望
参考文献
附录A 噬菌体G1基因组注释结果
附录B 噬菌体LS1基因组注释结果
附录C 噬菌体C1基因组注释结果
攻读硕士学位期间发表学术论文和申请专利申请情况
致谢

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 Hong Wu;Claus Moser;Heng-Zhuang Wang;Niels Hφiby;Zhi-Jun Song;;Strategies for combating bacterial biofilm infections[J];International Journal of Oral Science;2015年01期

2 艾启俊;于庆华;张红星;张馨如;刘一倩;瓢金港;;PCR技术检测编码绿脓杆菌外毒素A基因[J];中国食品学报;2006年06期

相关博士学位论文 前1条

1 曹振辉;铜绿假单胞菌裂解性噬菌体的筛选、鉴定及应用[D];大连理工大学;2015年

相关硕士学位论文 前2条

1 曹放;应用裂解性噬菌体治疗多重耐药肺炎克雷伯氏菌引起的小鼠肺炎[D];大连理工大学;2014年

2 杨扬;应用噬菌体防治弧菌引发的刺参腐皮综合征[D];大连理工大学;2013年

本文编号：2859412