褪黑素缓解瘙痒的分子机制研究

发布时间：2020-10-28 13:30

　　 目的:首先在ICR小鼠上建立48/80和CQ诱导的急性瘙痒模型和包括银屑病样以及干皮病样慢性瘙痒模型,再给予褪黑素(melatonin)处理,采用药理学、行为学方法、流式细胞技术、分子细胞生物学等技术,来研究褪黑素抑制急性瘙痒和慢性瘙痒的分子机制。方法:(1)将成年ICR小鼠进行昼夜节律实验,早八点至晚八点正常光照,晚八点至早八点完全避光。两周后,再随机分成五组分别是对照组(Vehicle组),银屑病组(PSO组),银屑病+褪黑素组(PSO+Melatonin组),干皮病组(AEW组),干皮病+褪黑素组(AEW+Melatonin组)。造模一周后,早晨六点眼眶取血,每隔六小时取一次,至第二天早六点。应用ELISA试剂盒检测血液中褪黑素的含量。(2)将成年雄性ICR小鼠在颈部注射100ug的48/80以及200ug CQ,通过三种不同给药方式分别是皮内混合注射,腹腔注射,鞘内注射不同剂量的褪黑素,观察并定量分析小鼠的瘙痒行为。3)将ICR成年雄性小鼠随机分成三组,一组仅做脱毛处理,不涂抹药物(Vehicle组),一组涂抹咪喹莫特乳膏(PSO组),最后一组涂抹咪喹莫特乳膏,并在第三天,第五天,第七天涂抹咪喹莫特乳膏前腹腔注射褪黑素(PSO+Melatonin组),每组5-9只。应用行为学方法,HE染色技术,检测褪黑素是否能缓解银屑病样瘙痒,小鼠角质细胞增殖情况。(4)将ICR成年雄性小鼠随机分成三组,一组仅做脱毛处理,不涂抹药物(Vehicle组),一组先涂抹丙酮和乙醚1:1,30秒,再涂抹水15秒(AEW组),一天两次,最后一组涂抹咪丙酮和乙醚1:1,30秒,再涂抹水15秒,并在第三天,第五天,第七天涂抹丙酮、乙醚和水前腹腔注射褪黑素(AEW+Melatonin组),每组5-9只。应用行为学方法,HE染色技术,检测褪黑素是否能缓解干皮病样瘙痒,小鼠角质细胞增殖情况。(5)应用荧光定量PCR技术,检测两种慢性瘙痒模型及褪黑素处理后炎症因子和受体的mRNA表达情况。(6)采用药理学的方法,将48/80和CQ分别与褪黑素以及褪黑素受体的拮抗剂4-4PDOT和Luzindole,混合皮内注射小鼠颈部,运用行为学的方法检测小鼠的搔抓行为。在银屑病和干皮病两种慢性瘙痒模型中,第三天,第五天,第七天处理褪黑素前半个小时腹腔注射EX527,运用行为学的方法检测小鼠的搔抓行为,看能否反转褪黑素抑制慢性瘙痒。(7)将ICR小鼠随机分组,分成对照组,银屑病组,银屑病加褪黑素组,干皮病组,干皮病加褪黑素组,造模七天后,取小鼠皮肤,颈膨大脊髓和皮肤组织,并应用蛋白免疫印迹检测p-AKT,p-ERK表达情况,确定褪黑素抑制慢性瘙痒和p-AKT,p-ERK之间的关系。结果:(1)在昼夜节律实验中,对照组小鼠褪黑素节律正常,银屑病和干皮病小鼠模型中褪黑素含量节律失调,褪黑素处理后褪黑素含量升高。(2)药理学实验显示,在小鼠急性痒模型中,褪黑素以皮内,腹腔,鞘内三种给药方式,均能抑制48/80和CQ诱发的瘙痒。(3)行为学实验结果显示,在银屑病和干皮病两种慢性瘙痒模型中,分别在第三天,第五天,第七天腹腔注射褪黑素,结果显示,褪黑素可以抑制慢性瘙痒。(4)定量PCR实验结果显示,慢性瘙痒模型中,炎症因子显著升高,在银屑病模型中,褪黑素可以抑制IL33,ST2表达。干皮病模型中,褪黑素可以抑制IL31,IL31RA表达。(5)在ND7-23细胞上,通过流式检测结果显示,褪黑素可以抑制48/80和CQ诱发的ROS,并且在银屑病模型上,抗氧化基因Sod2有明显降低,给褪黑素后能够反转其表达。(6)药理学实验结果显示,在小鼠急性痒模型中,褪黑素受体拮抗剂4-4PDOT,Luzindole能够反转褪黑素抑制48/80和CQ诱发的瘙痒。(7)Western blotting结果显示,褪黑素抑制银屑病皮肤上p-AKT的表达,可以缓解干皮病脊髓上p-ERK表达。结论:(1)慢性瘙痒小鼠模型褪黑素昼夜节律失调。(2)褪黑素可以抑制小鼠急性痒和慢性瘙痒。(3)抗氧化应激和抗炎症在褪黑素抑制诱急性瘙痒和慢性瘙痒中发挥重要作用。(4)P-AKT和p-ERK在褪黑素抑制慢性瘙痒中发挥作用。
【学位单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R338.3
【部分图文】：

AEW+melatoninAEWVehicle 图 4 腹腔注射褪黑素能缓解银屑病样和干皮病样皮肤病理(A）银屑病小鼠皮肤组织 HE 染色，蓝色为细胞核皮肤厚度统计图(n=10-15;***P<0.001 vs Vehicle;###P<0

图 5 慢性瘙痒动物模型褪黑素昼夜节律失调(A)对照组褪黑素昼夜节律明显，银屑病组和干皮病组褪黑素昼夜节律失调(n=3; *P<0.05 vs Vehicle，未配对 t 检验；所有数据均用 Mean ± SEM 表示)。(B) 银屑病+褪黑素组小鼠血液褪黑素含量升高 (n=3;*P<0.05 vs PSO，未配对 t 检验；所

图 7 褪黑素抑制急性瘙痒与缓解氧化应激有关（A,B）流式细胞仪检测细胞内活性氧含量示意图。峰值右移说明胞内 ROS产生量升高，左移表明 ROS 含量减少。（C,D） 胞内 ROS 含量的统计图。48/80和 CQ 能够显著增加胞内 ROS 的产生，同时褪黑素可以显著降低 48/80 和 CQ 诱
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本文编号：2860152