斑马鱼非经典炎症小体调控抗感染和内毒素休克效应

发布时间：2020-10-28 13:34

　　 先天免疫系统是生物体中天然的抵御外界病原微生物入侵的防御机制,是宿主产生适应性免疫应答的基础。炎症小体作为一种由细胞胞浆内先天免疫识别受体参与组装的多蛋白复合物,是细胞质先天免疫系统的重要组成。目前炎症小体在哺乳动物中主要分为caspase-1介导的经典炎症小体和caspase-11(鼠)或者caspase-4/5(人)介导的非经典炎症小体。近期研究表明,非经典炎症小体caspase-4/5/11通过其CARD结构域,可以识别胞内革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS,又称内毒素),激活非经典炎症小体通路,导致细胞焦亡,并诱导IL-1β和IL-18等炎性细胞因子的成熟和分泌。该过程在拮抗和清除病原感染过程中具有重要意义,同时,也在调控革兰氏阴性菌诱导的内毒素休克效应中发挥了关键作用。本课题组前期研究结果显示,相对于野生型杀鱼爱德华氏菌EIB202感染而言,溶血素过表达杀鱼爱德华氏菌09901感染斑马鱼ZF4细胞后,能够诱导显著的细胞焦亡效应。在此基础上,鉴定出斑马鱼caspy2在识别细胞内LPS过程中发挥了关键作用。因此,本论文拟进一步阐明斑马鱼caspy2介导的非经典炎症小体激活在宿主黏膜免疫过程中发挥的功能,并探索斑马鱼caspy2非经典炎症小体激活介导的内毒素休克效应的分子机制。首先,本论文考察了 caspy2在斑马鱼发育过程中的表达情况,结果发现该蛋白从斑马鱼受精卵发育后48 h开始,出现了显著的持续性表达。其次,采用斑马鱼幼鱼整胚原位杂交技术,发现在斑马鱼胚胎发育过程中,caspy2主要在嘴、咽弓和肠道中具有显著的表达,暗示其可能在黏膜免疫过程中发挥关键功能。然后,本论文采用吗啉代反义寡核苷酸(Morpholino)显微注射斑马鱼胚胎技术,建立了 caspy2敲降斑马鱼幼鱼活体模型。在此基础上,本论文进一步建立了 5 dpf斑马鱼幼鱼浸泡感染杀鱼爱德华氏菌模型。结果发现,相对于EIB202侵染而言,09091突变株侵染斑马鱼后,能够检测到显著的caspy2激活现象。同时,采用09091侵染野生型或caspy2敲降斑马鱼幼鱼发现,caspy2的敲降会导致幼鱼死亡率显著升高。并且,通过幼鱼体内细菌定殖检测发现,09091在caspy2敲降斑马鱼中的病原定殖能力显著高于野生型斑马鱼。更有趣的是,通过斑马鱼活体显微观察发现,09091感染caspy2敲降斑马鱼后,细菌能够显著突破肠道屏障,向背弓和肌肉组织中进行扩散感染。进一步通过组织病理学观察发现,在病原菌感染过程中,caspy2对于维持斑马鱼幼鱼肠道的完整性具有重要作用。综上所述,本论文结果阐明了斑马鱼caspy2非经典炎症小体激活在宿主黏膜免疫过程中发挥的至关重要的作用。其次,为了进一步考察斑马鱼caspy2非经典炎症小体激活是否在内毒素休克过程中发挥作用,本研究采用致死剂量LPS浸泡感染斑马鱼幼鱼,建立了斑马鱼内毒素休克模型。结果发现,相对于野生型斑马鱼幼鱼而言,caspy2敲降斑马鱼幼鱼的存活率显著提高。同时,在caspy2敲降斑马鱼感染组,由内毒素休克效应引起的心包水肿和组织糜烂的症状明显弱于野生型斑马鱼感染组。并且,通过检测IL-lβ、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10和IFN-y等炎症相关细胞因子的表达发现,caspy2的敲降能够显著降低细胞因子风暴的发生。因此,本论文进一步阐明了斑马鱼caspy2非经典炎症小体在介导内毒素休克效应过程中发挥了至关重要的作用。综上所述,本论文解析了斑马鱼caspy2非经典炎症小体激活在宿主抵御病原感染过程中发挥的重要功能。同时,靶向敲降斑马鱼caspy2能够有效减弱斑马鱼幼鱼内毒素休克效应的发生。该研究成果为进一步在活体水平上研究非经典炎症小体信号通路激活的分子机制奠定基础,也为临床筛选治疗内毒素休克效应的靶向药物提供了一定的线索。
【学位单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R392
【部分图文】：

?华东理工大学硕士学位论文??形成的ＧＳＤＭＤ－Ｎ端促进了细胞焦亡和ＮＬＰＲ３依赖的ｃａｓｐａｓｅ－１的蛋白水解（图１．２）。??Ｓｈｉ等［２８］发现ＧＳＤＭＤ的敲除显著减弱了?ＬＰＳ诱导的巨噬细胞焦亡效应和ＩＬ－１Ｐ的分泌，??并且ＧＳＤＭＤ并不影响ｃａｓｐａｓｅ－１１的激活和ＩＬ－ｉｐ的成熟，表明ＧＳＤＭＤ在ｃａｓｐａｓｅ－１??的下游，仅仅在ｃａｓｐａｓｅ－１１非经典炎症小体诱导的细胞焦亡和ＩＬ－ｉｐ的分泌过程中发挥??了重要的作用（图１．２ｈＡｇｌｉｅｔｔｉ等ｔ２９］发现ＧＳＤＭＤ－Ｎ端能够在质膜上形成结构稳定的环??状孔洞，且ＧＳＤＭＤ－Ｎ端的定位及其环状结构仅可见于ＬＰＳ诱导激活ｃａｓｐａｓｅ－１１的巨噬??细胞中。巨噬细胞中完整的ＧＳＤＭＤ没有生物学活性，激活的ｃａｓｐａｓｅ－１１可以切割其Ｎ??端和Ｃ端的连接结构，使之形成独立的Ｎ端和Ｃ端蛋白，从而解除了?ＧＳＤＭＤ－Ｎ端蛋??白固有的打孔活性的自抑制状态［２］。具有打孔活性的ＧＳＤＭＤ－Ｎ端蛋白转移到质膜上，??与膜结构结合并形成１０？１４?ｎｍ直径的孔洞

??１．３模式生物斑马鱼??１．３．１斑马鱼作为感染免疫互作模型??斑马鱼是近年来研究热门的明星模式动物，其具有一系列的优点：（１）易于存活和??培养；（２）体外受精，胚胎发育外显；（３）生命早期的光学透明性，易于观察；（４）易于??敲除和敲进的基因遗传学；（５）具有脊椎动物的生理学功能；（６）斑马鱼具有较强的繁??殖力，能够提供大量的实验样本；（７）与哺乳动物相比，斑马鱼的免疫系统具有良好的??保守性；（８）斑马鱼中的类似髓样细胞衍生的免疫细胞均己被鉴定［４２］，包括单核细胞、??巨噬细胞（Ｍｌ和Ｍ２亚型）、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和与ＮＫ细胞相似??的杀伤性细胞。其造血发生在斑马鱼发育的２２?ｈｐｆ。到４８?ｈｐｆ，胚胎具有了完整功能的??巨噬细胞和中性粒细胞，它们能够识别并响应入侵的细菌病原菌。发育到约３?ｄｐｆ时，??胚胎会从胚膜孵化出来，同时肠道微生物开始定殖。此时，幼鱼中会出现Ｂ细胞和Ｔ??细胞前体Ｒａｇ依赖的重组，但是其适应性免疫系统在幼鱼约４周龄时才发挥功能。图??１．３显示了斑马鱼幼鱼时期免疫系统发育的各个重要时间点。??

?第１３页??的非经典炎症小体激活过程中发挥了至关重要的作用（图１．４）。??Ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ?Ｃａｓｐｙ２?ＫＯ?Ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ?Ｃａｓｐｙ２?ＫＯ?ＷＭ－ｔｙｐｅ?Ｃａｓｐｙ２?ＫＯ??圣?４１?４１?６０－｜?＊?６０－１?ｃ７?＾??｜?＊?一土?－ｐｒｏ－ｃａｓｐｙ２??ｉｆ?ｉ?：?ｒ°?ｉ４０?；ｆ?．?，Ｐ２〇??Ｉ?ｉｎｉ?ｉｌｉｉ１２０遍＿２?ｊａｉｌ??一??图１．４?Ｃａｓｐｙ２介导胞内ＬＰＳ诱导的非经典炎症小体的激活??Ｆｉｇ．?１．４?Ｃａｓｐｙ２?ｇａｔｅｓ?ｔｈｅ?ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ?ＬＰＳ?ｍｅｄｉａｔｅｄ?ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ?ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ?ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．??通过进一步研究发现，和哺乳动物非经典炎症小体激活具有一定的相似性和差异性，??ｃａｓｐｙ２的Ｐｙｒｉｎ结构域能够与胞内ＬＰＳ直接结合，引起ｃａｓｐｙ２寡聚化，然后激活斑马鱼??非经典炎症小体
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