骨髓间充质干细胞向成肌细胞诱导分化及大鼠间异体移植的研究

发布时间：2020-10-31 17:52

　　 目的：骨髓间充质干细胞（MSCs）具有向成肌细胞、成骨细胞、成软骨细胞、成脂细胞及神经细胞等多种成熟细胞分化的潜能，其来源丰富，分离、培养较为容易，在体外可多次扩增，自体移植不存在组织配型及免疫排斥的问题。由于MSCs具有上述优点，使其引起了广泛的关注，尤其是组织修复方面，可将其应用于器官及组织的修复治疗中。本实验通过研究骨髓间充质干细胞在不同条件下分离、纯化、传代、鉴定及诱导，得出培养骨髓间充质干细胞的最佳培养条件。并进一步用5-氮杂胞苷（5-Aza-CR）诱导其向成肌细胞分化，将诱导后的干细胞用BrdU标定，移植入SD大鼠膀胱肌层，观察其在膀胱肌层的存活及分布状况。 方法：(1) MSCs的分离培养(2) MSCs的鉴定(3) MSCs的传代培养(4)不同种植密度对MSCs生长的影响(5)不同浓度胎牛血清对MSCs生长的影响(6)传代细胞的生长曲线(7)5-Aza-CR诱导MSCs分化为成肌细胞(8) MSCs受5-Aza-CR诱导后肌分化相关蛋白的表达(9) BrdU转染及鉴定(10)骨髓间充质干细胞异体移植 结果：(1) MSCs的分离培养脱颈处死6周龄SD大鼠1只，75％酒精浸泡5min灭菌，取出大鼠双侧胫骨及股骨，剪去长骨两端，暴露骨髓腔，5ml注射器反复冲洗得到单细胞悬液，移入细胞培养瓶中。根据MSCs与杂质细胞的贴壁时间差纯化干细胞，镜下可见细胞开始贴壁变形，原代干细胞呈圆形、三角形、多角形，杂质细胞形态呈圆形或不贴壁。培养48h后,显微镜下观察可见贴壁细胞数量明显增多，部分呈集落样生长。培养4～6d后,贴壁细胞分裂增殖明显,可见较多的分裂相,随着细胞数目增多，二维生长的干细胞群内空间趋于狭窄，故出现漩涡样，成纤维样细胞集落。(2) MSCs的鉴定对干细胞的鉴定仍然是一个难题，目前尚无统一的、权威的标准。目前的现状是，大多数人采用联合应用多种抗体分离鉴定MSCs，一般采用排除法或推逆法对其进行鉴定。目前最常用的间充质干细胞阳性标记物有：SH-2、SH-3、SH-4、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105、CD166等；阴性标记物有：CD14、CD34、CD45、CD34、CD31、VWF等，本实验选择CD29，CD44作为阳性标记物，CD34，CD45作为阴性标记物，以免疫组化法检测细胞特异性抗原。(3) MSCs传代培养10-14天，细胞密度逐步增加，融合成片。传代接种后的细胞分布均匀，以梭状为主。传1、2代的MSCs形态均一，呈长梭形，杂质细胞随传代、换液逐渐减少。培养至传P8(传八代)细胞，干细胞仍然存活，但细胞生长缓慢，形态开始变化，折光性较差，开始脱壁凋亡。(4)不同种植密度对MSCs生长的影响在106/ml密度接种时MTT比色法检测OD490值最大，活细胞数量多，细胞活性较好，较利于MSCs的生长。(5)不同浓度胎牛血清对MSCs生长的影响在10%～15%的胎牛血清浓度时MTT比色法检测OD490最高，证明10%～15%血清浓度最适宜MSCs生长。(6)传代细胞的生长曲线细胞生长曲线呈S形，增殖包括滞留期、对数生长期、平台期三个时期，P1(传一代)细胞增殖较快，其速度明显快于其他时期。(7)5-Aza-CR诱导MSCs最适浓度测定及诱导效果不同浓度5-Aza-CR诱导MSCs，在10umol/L的浓度时MTT比色法检测OD490最高，证明10umol/L5-Aza-CR浓度最适宜MSCs诱导。以10umol/L5-Aza-CR诱导传MSCs，4d后未发现干细胞胞体明显变化，10d见小部分细胞胞体增大、变长，13d可见部分细胞相互接触，至15d-17d可见有类肌管样结构出现。(8) MSCs受5-Aza-CR诱导后肌分化相关蛋白的表达诱导后的细胞4d检测，未发现细胞表达肌细胞特异抗原，诱导后的细胞12d后，细胞表达desmin（结蛋白）明显呈阳性，5-Aza-CR诱导后14d表达myosin（肌动蛋白重链）程度明显呈阳性。(9) BrdU转染及鉴定在传3代干细胞中加入含BrdU40μg/ml标记培养基，转染48h，观察可见细胞生长良好，悬浮死亡细胞较少，进一步铺片以免疫组化法检测转染情况，可见部分细胞核呈棕黄色，说明转染成功。(10)骨髓间充质干细胞异体移植将诱导后的干细胞用BrdU标定，手术直视下移植入大鼠膀胱内，4周后取出大鼠膀胱，以免疫组化法检测发现，移植细胞在活体大鼠膀胱内可继续生存且分布均匀。 结论：(1)骨髓提取培养后得到的不是单一种类细胞，骨髓间充质干细胞只占其中一小部分，需要人为施加影响因素，使其扩增，纯化，最终形成以干细胞为主的细胞群落。(2) MSCs生长先慢后快再慢，呈典型的S型曲线，在实验中我们发现P4以内的MSCs适应能力强，形态稳定，代谢旺盛，可用于后续实验研究。(3)初次换液最佳时间为2-4小时，视具体情况而定，换液间隔一般为3-5天，传代时间可根据实验需求灵活掌握。(4)最适合MSCs生长的环境为含10%胎牛血清和90%DMEM（L）的培养液，最适合MSCs向成肌细胞分化的环境为10%马血清、90%DMEM（L）和10μmol/L5-Aza-CR构成的诱导培养体系。(5)诱导后干细胞desmin（结蛋白）、myosin（肌动蛋白重链）均呈阳性表达，说明5-Aza-CR诱导MSCs向成肌细胞分化成功。(6)经鉴定，本实验提取的干细胞细胞表面标记抗原CD29，CD44呈阳性表达，CD34，CD45呈阴性表达，说明本实验培养体系中的主要细胞为骨髓间充质干细胞，纯度高，活性大，可以用于实验研究。(7)经检测，SD大鼠骨髓间充质干细胞在移植入膀胱逼尿肌无力模型鼠后，可继续存活于大鼠膀胱肌层内，移植后连续观察实验鼠3个月，未发现有不良反应，实验证实：SD大鼠骨髓间充质干细胞异体移植安全、有效。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2012
【中图分类】：R329
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
前言
材料与方法
结果
附图
附表
讨论
结论
参考文献
综述 间充质干细胞的研究现状
    参考文献
致谢
个人简历

【参考文献】

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本文编号：2864298