人肠道来源大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因突变株的构建

发布时间：2020-10-31 20:57

　　 目的:使用嗜热二型内含子基因失活系统(Thermotargetron)失活人肠道来源大肠杆菌(HSM174 DE3)β-半乳糖苷酶基因(LacZ),构建lacZ失活突变株。方法:使用分子克隆方法,构建lacZ基因失活质粒pHK-TT1A-lacZ426a、pHK-TT1A-lacZ1879a、pHK-TT1A-lacZ1880a及pHK-TT1A-lacZ1155s,将基因失活质粒转化大肠杆菌HSM174菌株(E.coli HSM174),转化子培养时提高温度至48℃,诱导TeI3c/4c二型内含子"归巢"活性,采用蓝白斑及PCR筛选lacZ基因失活突变株。结果:随机挑选20株克隆菌株的PCR结果显示,lacZ426a、lacZ1879a、lacZ1880a及lacZ1155s基因失活效率分别为60%、75%、60%及75%;白斑克隆基因失活效率为100%。结论:Thermotargetron系统可高效的实现E.coli HSM 174菌株lacZ基因失活,并可能具有在中温菌中广泛应用的潜力。
【部分图文】：

E. coli HSM174 lacZ 基因(ECHMS174_00351)全长3 075 bp,在lacZ基因中5′-AAcgccatcaaaaatA-3′(426a)、5′-AAcggaactggaaaaA-3′(1 879a)、5′-AAa-cggaactggaaaA-3′(1 880a)及5′-AAgcagaacaactttA-3′(1 155s)四个位点符合TeI3c/4c识别规律(图1A)。使用引物突变野生型TeI3c/4c IBS1、IBS2、EBS1及EBS2位点(图1B),构建针对lacZ基因426a,1 879a,1 880a和1 155s四个识别位点的打靶质粒pHK-TT1A-lacZ426a、pHK-TT1A-lacZ1879a、pHK-TT1A-lacZ1880a及pHK-TT1A-lacZ1155s(图1)。2.2 E. coli HSM174 lacZ 基因敲除载体的构建

pHK-TT1A-lacZ426a、pHK-TT1A-lacZ1879a、pHK-TT1A-lacZ1880a及pHK-TT1A-lacZ1155s载体转化E. coli HSM174感受态细胞,转化效率=104 CFU/μg DNA。转化子在LB-Chl的平板上(添加X-gal)形成白色和蓝色的克隆(图3A, 图3B)。使用lacZ基因外侧引物(DPlacZ-F/R)检测白色克隆,突变株因TeI3c/4c插入,PCR检测产物分子量比野生型大(WT=3176 bp vs mutant=3 976 bp,图3C),白色克隆lacZ失活率为100%(图3C)。为了计算突变效率,转化子被涂布在LB-Chl平板上,随机挑选20个转化子克隆(培养基中不加入X-gal)检测lacZ基因是否插入失活。结果显示pHK-TT1A-lacZ426a、pHK-TT1A-lacZ1879a、pHK-TT1A-lacZ1880a及pHK-TT1A-lacZ1155s打靶载体的基因失活效率分别为60%、75%、60%和75%(表4)。表1 菌株序列(特征)及来源Tab.1 Strain sequence (characteristics) and its origin 菌株 序列或特征 来源 HMS174(DE3) F- recA1 hsdR(rK12- mK12+) (DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) (Rif R) Novagen NEB express competent E. coli (high efficiency) fhuA2 [Ion] ompT gal sulA11R(mcr-73::miniTn10--TetS)2[dcm]R(zgb-210::Tn10--TetS)endAdelta(mcrC-mrr)114::IS10 NEB HMS174(DE3) lacZ::lacZ426a HMS174(DE3) 来源,lacZ::lacZ426a 本研究 HMS174(DE3) lacZ::lacZ1155s HMS174(DE3) 来源,lacZ::lacZ1155s 本研究 HMS174(DE3) lacZ::lacZ1880a HMS174(DE3) 来源,lacZ::lacZ1880a 本研究 HMS174(DE3) lacZ::acZ1879a HMS174(DE3) 来源,lacZ::acZ1879a 本研究

表3 引物序列(特征)及来源Tab.3 Sequence (characteristics) and Source of primers 引物 序列或特征 来源 lacZ426aIBS12 AGCCAAAGCAGGTTGACTAGTAAcgccatcaaaaatGTGCGACGCGAAAGCTAG 本研究 lacZ426aEBS2s CGCTAGAAGCCTCGTTAtggcgAGCAGGCCAAAGATGCTG 本研究 lacZ426aEBS1a CGGAGTTGCTGTCCCCGTACGCTGAaaaaatAGCAGCGtATCCAATCC 本研究 LacZ1879aIBS12 AGCCAAAGCAGGTTGACTAGTAAcggaactggaaaaGTGCGACGCGAAAGCTAG 本研究 LacZ1879aIBS2s CGCTAGAAGCCTCGTTAttccgAGCAGGCCAAAGATGCTG 本研究 LacZ1879aIBS1a CGGAGTTGCTGTCCCCGTACGCTGAggaaaaAGCAGCGtATCCAATCC 本研究 lacZ1880aIBS12 AGCCAAAGCAGGTTGACTAGTAAacggaactggaaaGTGCGACGCGAAAGCTAG 本研究 lacZ1880aEBS2s CGCTAGAAGCCTCGTTAtccgtAGCAGGCCAAAGATGCTG 本研究 lacZ1880aEBS1a CGGAGTTGCTGTCCCCGTACGCTGAtggaaaAGCAGCGtATCCAATCC 本研究 LacZ1155sIBS12 AGCCAAAGCAGGTTGACTAGTAAgcagaacaactttGTGCGACGCGAAAGCTAG 本研究 LacZ1155sIBS2s CGCTAGAAGCCTCGTTAtctgcAGCAGGCCAAAGATGCTG 本研究 LacZ1155sIBS1a CGGAGTTGCTGTCCCCGTACGCTGAaactttAGCAGCGTATCCAATCC 本研究 Tel3cUNV TAACGAGGCTTCTAGCG 文献[1] DPlacZ-F TTACGCGAAATACGGGCAG 本研究 DPlacZ-R CTTCCGGCTCGTATGTTGT 本研究表4 Thermotargetron失活lacZ基因Tab.4 Thermoargtron-inactivated lacZ gene 打靶质粒 打靶基因 长度(bp) 识别序列 失活效率(%) pHK-TT1A-lacZ426a lacZ 3 075 CGCCATCAAAAAT 60 pHK-TT1A-lacZ1879a lacZ 3 075 CGGAACTGGAAAA 75 pHK-TT1A-lacZ1880a lacZ 3 075 ACGGAACTGGAAA 60 pHK-TT1A-lacZ1155s lacZ 3 075 GCAGAACAACTTT 75
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本文编号：2864500