pcDNA3.1-Survivin-V5-IRES-EGFP表达载体的构建及其对MS1细胞凋亡作用的探讨

发布时间：2020-11-01 06:47

　　 目的 本研究旨在关注Survivin过表达载体对MS1细胞的部分生物学特性的影响，拟对转染后的MS1细胞测其细胞凋亡及核酸蛋白的影响。方法 1.研究对象为小鼠胰岛内皮细胞（MS1细胞）。 2.据GenBank提供的基因序列，构建含Survivin基因的质粒载体。 3.培养MS1细胞，以脂质体法转染细胞，设计分组：空白对照组（A组）、脂质体转染对照组（B组）、空质粒组（C组）、实验组（D组pcDNA3.1-Survivin-V5-IRES-EGFP质粒转染细胞）。 4.通过流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化。 5.Real time PCR测Survivin mRNA表达水平；Western blot测细胞survivin蛋白的表达量。 结果 1.经测序鉴定，重组质粒表达载体中目的基因片段及插入方向正确； 2.脂质体介导转染MS1细胞，在荧光显微镜下观察到绿色荧光。 3.Real time PCR证实MS1细胞中survivin微量表达或极低表达，实验组较对照组增加约124倍。 4.Western blot结果证实了对照组survivin蛋白表达微量，转染的MS1细胞survivin蛋白量明显增加。 5.流式细胞术检测，细胞的转染率为20%，实验组细胞凋亡率（6.04±0.12）％,低于空白对照组（6.69±0.34）％,脂质体转染对照组（6.30±0.23）％，空质粒组（6.53±0.46）％，有明显差异（P﹤0.05）。 结论 1.成功构建含survivin基因的重组质粒真核表达载体。 2. survivin基因表达载体可明显提高MS1细胞内Survivin mRNA及蛋白的表达。 3.survivin基因表达载体可降低细胞凋亡率，为后期将高表达survivin的MS1细胞接种于动物实验奠定了一定的理论基础。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2012
【中图分类】：R363
【部分图文】：

图 1.Survivin 基因合成Fig1 synthesis of survivin gene（1）分析并检查所需合成基因，注意基因内的特别复杂二级结构和重复序列；（2）据分析基因序列的结果，应用 oligo 软件行单链 oligo 的设计及合成；（3） 通过 PCR 拼接合成的 oligo 为完整的基因；（4） pMD-18T 载体与合成的基因序列连接并转化；（5） 重组克隆中基因序列测序验证。（6）若基因序列存在突变点，则由重叠 PCR 修复；（7）含有正确目的基因的 T 载体质粒编号为 v394-7。1.3.2 pcDNA3.1-Survivin-V5-IRES-EGFP 表达载体的构建

图 2.pcDNA3.1-Survivin-V5-IRES-EGFP 质粒载体构建图Fig2. pcDNA3.1-Survivin-V5-IRES-EGFP plasmid vector construction 1.3.2.1 序列拼接(1)设计目的基因 survivin-IRES2-EGFP 的 PCR 拼接引物。引物序列酶切位点，上游为 NheI，下游为 NotI；绿色为 PCR 拼接引物重叠区引物 1 5'-ATTATTGCTAGCGCCACCATGGGAGCTCCGGCGCTGC-引物 2 5'-TAGGGGGGGGGGAGGGAGAGGGGCGGATCCTTAGGCCTGCTCAATTG-3'引 物物 35'-CGTCAGTCAATTGAGCAGCTGGCTGCCTAAGGATCCGTCCCTC-3'引物 4 5'-ATTATTGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC

1: surviving 2: IRES2-EGFP 3: marker图 3 PCR 扩增小鼠 survivin 基因及 IRES2-EGFP 电泳图Fig3 Electropherogram of PCR amplificating survivi2.2 将目的基因 survivin 片段与 IRES2-EGFP 进行 PCR 拼将目的基因survivin片段与IRES2-EGFP进行PCR拼接，得重组片段，扩增产物在 1.0%琼脂糖凝胶电泳中呈现一 200的片段 survivin438bp 和 IRES2-EGFP 1500bp 大小，说明
【参考文献】

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本文编号：2865170