建立仙台病毒实时荧光重组酶等温扩增检测方法

发布时间：2020-11-02 19:24

　　 目的国标标准规定清洁级和SPF级小鼠必须排除仙台病毒(Sendai virus,SeV)。为了提升效率,简化操作步骤,本研究建立了一种新型分子检测方法——实时荧光重组酶等温扩增技术(real-time RPA)用于检测SeV。方法针对SeV融合蛋白编码基因的保守序列,设计特异性扩增引物及探针并建立检测方法,并评价该检测方法的特异性、敏感性、稳定性和可靠性。最后将该检测方法和团标PCR方法进行优势比较。结果该方法具有很好的特异性,与小鼠肝炎病毒等六种病原微生物无交叉反应。其敏感性、稳定性和可靠性均可,并能够在25 min内完成,远远快于PCR方法。结论本研究建立的SeV实时荧光RPA是一种操作简单,高效直观且特异性好的检测方法。
【部分图文】：

本研究评估实时荧光RPA的敏感性，使用10倍倍比稀释SeV cDNA制备浓度梯度100 ng/μL到100 fg/μL，作为反应的模板。实时荧光RPA反应中，前四个梯度能随着时间的推移有大量的荧光信号累积(图2)。图2 实时荧光RPA扩增中Se V稀释梯度的荧光信号

实时荧光RPA扩增中Se V稀释梯度的荧光信号

本研究PCR方法为团体标准中的方法，反应模板浓度梯度100 ng/μL到100 fg/μL和实时荧光RPA模板浓度梯度相同。PCR产物电泳图中，前四个泳道可见目标条道(图5)。因此，如图2和图5所示这两种方法检测下限一致。PCR反应完成需要100 min，跑胶及拍照耗时30 min，总计130 min,而实时荧光RPA扩增和检测信号是实时呈现，全程仅需25 min，通常在6～20 min之间即可观察到结果，大大缩短了检测时间。另外，比起PCR仪，实时荧光RPA检测仪Genie II，更加小巧轻便且自带电池，适合现场检测。图4 Se V实时荧光RPA方法的峰值时间
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