不同程度过氧化氢通过线粒体ROS调控PC12细胞存活与死亡的实验研究

发布时间：2017-04-05 08:10

  本文关键词：不同程度过氧化氢通过线粒体ROS调控PC12细胞存活与死亡的实验研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：传统观点认为,线粒体活性氧(mitochondrial reactive oxygen species,m ROS)的作用仅仅是引起细胞损伤而导致众多疾病的发生,因此m ROS被认为是氧化代谢中的一种有害产物而缺少正常的生理功能。然而,越来越多的研究表明,m ROS在维持正常细胞功能中也发挥关键作用,例如,在缺氧、饥饿、病原体感染以及生长因子刺激下通常诱导细胞产生m ROS,转而激活下游m ROS-依赖的信号转导途径,后者具有维持细胞稳态和促进细胞应对刺激适应性的功能。有研究报道氧化应激能扰乱内质网功能,活化内质网应激以及下游的自噬过程。根据氧化应激严重程度的不同,内质网应激及其后续活化的自噬可发挥促细胞存活或死亡的双重作用。大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞是一个体外研究神经细胞的常用模型。当培养基中有动物血清存在时,PC12细胞呈圆形、胞体明亮、迅速增殖。在此条件下,PC12细胞表现出许多不成熟神经细胞特性,可以转变成肾上腺嗜铬细胞,也可以变成交感样神经细胞。在神经生长因子诱导下,PC12细胞能分化成交感神经样细胞,具有神经元的形态、生化和生理特征。PC12细胞的这些特性使得它成为研究神经系统疾病发病机制以及探索相关治疗手段的一种简单且便利的细胞模型。本实验以PC12细胞作为研究对象,采用不同浓度H2O2模拟不同程度氧化应激,探讨在不同程度氧化应激条件下,线粒体ROS以及内质网应激-自噬途径相关联的信号转导在调控神经细胞存活与死亡过程中的作用。方法和结果:1、不同浓度H2O2刺激PC12细胞6h后,MTT实验检测细胞存活率。结果显示:与对照组相比,较低浓度H2O2刺激下PC12细胞的存活率无显著变化;高浓度H2O2刺激下PC12细胞的存活率显著降低。2、分别采用低浓度H2O2以及高浓度H2O2刺激PC12细胞6h,倒置光学显微镜下观察细胞形态的变化。结果显示:与对照组相比,低浓度H2O2刺激不引起光学显微镜下可见的细胞形态改变;高浓度H2O2刺激引起细胞形态发生明显变化。3、分别采用低浓度H2O2以及高浓度H2O2刺激PC12细胞6h,应用western blot检测细胞凋亡指示蛋白caspase-3的表达情况。结果显示:与对照组相比,低浓度H2O2刺激不改变caspase-3的活化即不引起细胞凋亡发生;高浓度H2O2刺激显著增加caspase-3的活化,即诱导细胞发生凋亡。4、分别采用低浓度H2O2以及高浓度H2O2刺激PC12细胞6h,应用流式细胞术检测线粒体膜电势的变化。结果显示:与对照组相比,低浓度H2O2刺激使PC12细胞的线粒体膜电势轻度降低;高浓度H2O2刺激使得PC12细胞的线粒体膜电势极显著降低。5、分别采用低浓度H2O2以及高浓度H2O2刺激PC12细胞6h,应用荧光染料Mito SoxTM红色试剂标记线粒体ROS。结果显示,不同程度H2O2刺激对PC12细胞线粒体ROS水平产生不同影响:与对照组相比,低浓度H2O2刺激使PC12细胞中线粒体ROS水平降低;高浓度H2O2刺激使PC12细胞中线粒体ROS水平显著增加。6、分别采用低浓度H2O2以及高浓度H2O2刺激PC12细胞6h,应用western blot检测线粒体介导的凋亡途径相关信号蛋白的表达情况。结果显示,不同程度H2O2刺激对PC12细胞的线粒体-介导的凋亡信号通路产生不同影响:与对照组相比,低浓度H2O2刺激上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,不影响线粒体凋亡蛋白caspase-9的表达;高浓度H2O2刺激显著降低Bcl-2的表达,同时显著上调caspase-9的表达。7、分别采用低浓度H2O2以及高浓度H2O2刺激PC12细胞6h,应用western blot检测内质网应激-自噬通路中相关蛋白的表达情况。结果显示:与对照组相比,低浓度H2O2刺激上调内质网应激标志蛋白GRP78的表达,不影响内质网应激途径的凋亡蛋白CHOP的表达以及自噬相关蛋白LC3、P62的表达;高浓度H2O2刺激显著上调GRP78、CHOP、LC3、P62蛋白的表达。结论:细胞应对不同程度氧化应激刺激时调动不同的应答反应。轻度氧化应激条件下,通过线粒体途径(降低线粒体ROS,上调抗凋亡Bcl-2信号)维持细胞的稳定状态;重度氧化应激条件下,通过线粒体ROS以及内质网应激-自噬途径同时触发死亡信号,诱导细胞发生线粒体介导的凋亡以及内质网应激介导的凋亡。
【关键词】：过氧化氢 PC12细胞 线粒体ROS 凋亡 内质网应激-自噬途径
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R363
【目录】：

• 前言4-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-15
• 英文缩写词15-16
• 第1章 文献综述16-29
• 1.1 氧化应激概述16-17
• 1.2 PC12细胞概述17-18
• 1.3 凋亡概述18-19
• 1.4 线粒体ROS概述19-23
• 1.4.1 线粒体产生ROS20
• 1.4.2 线粒体ROS的调节20-23
• 1.5 内质网应激与自噬概述23-29
• 1.5.1 内质网应激与未折叠蛋白反应23-25
• 1.5.2 自噬25-27
• 1.5.3 内质网应激与自噬的联系27-29
• 第2章 实验材料与方法29-37
• 2.1 实验材料29-31
• 2.1.1 仪器29-30
• 2.1.2 试剂30-31
• 2.2 实验方法31-37
• 2.2.1 细胞培养31-32
• 2.2.2 MTT法检测细胞存活率32
• 2.2.3 倒置光学显微镜观察细胞形态32-33
• 2.2.4 Bradford试剂盒测定细胞总蛋白浓度33
• 2.2.5 RIPA法提取细胞中总蛋白33-34
• 2.2.6 蛋白免疫印迹实验34-35
• 2.2.7 JC-1 试剂盒检测线粒体膜电势35
• 2.2.8 MiToSox~(TM)试剂盒检测线粒体超氧化物的生成35-36
• 2.2.9 统计学方法36-37
• 第3章 实验结果37-45
• 3.1 不同程度H_2O_2刺激对PC12细胞存活与死亡的影响37-38
• 3.1.1 不同浓度H_2O_2刺激对PC12细胞存活率的影响37
• 3.1.2 不同程度H_2O_2刺激对PC12细胞形态的影响37-38
• 3.2 不同程度H_2O_2刺激对PC12细胞存活与凋亡的影响38-39
• 3.3 不同程度H_2O_2刺激对PC12细胞线粒体ROS-介导信号的影响39-42
• 3.3.1 不同程度H_2O_2刺激对PC12细胞线粒体膜电势的影响39-40
• 3.3.2 不同程度H_2O_2刺激对PC12细胞线粒体ROS水平的影响40-41
• 3.3.3 不同程度H_2O_2刺激对PC12细胞线粒体凋亡关联蛋白的影响41-42
• 3.4 不同程度H_2O_2刺激对PC12细胞内质网应激-自噬通路的影响42-45
• 3.4.1 不同程度H_2O_2刺激对PC12细胞内质网应激通路相关蛋白的影响42-43
• 3.4.2 不同程度H_2O_2刺激对PC12细胞自噬通路相关蛋白的影响43-45
• 第4章 讨论45-50
• 第5章 结论50-51
• 参考文献51-62
• 致谢62

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  本文关键词：不同程度过氧化氢通过线粒体ROS调控PC12细胞存活与死亡的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：286753