中华按蚊细胞色素P450超基因家族溴氰菊酯抗性相关主效基因研究

发布时间：2020-11-04 20:30

　　 中华按蚊(Anopheles sinensis)是疟疾与丝虫病的重要媒介,在我国的分布范围十分广泛,是我国平原水网和水稻种植地区的优势蚊种。蚊媒控制在疟疾防治与消除工作中具有极其重要的作用,其中以杀虫剂室内滞留喷洒与药浸蚊帐为主的成蚊干预方法是目前最主要的蚊媒控制措施。溴氰菊酯杀虫剂由于高效低毒的特点被长期大范围的使用,对控制疟疾在我国的流行起到了重要作用。近年来,全国杀虫剂抗性监测显示各地的中华按蚊已经对溴氰菊酯杀虫剂产生了不同程度的抗性,蚊虫杀虫剂抗性已经成为当前蚊媒控制的重要威胁。本研究通过对溴氰菊酯抗性相关细胞色素P450基因(CYP基因)在不同抗性水平的中华按蚊体内的表达水平的比较,分析在中华按蚊溴氰菊酯抗性产生中发挥主要作用的CYP基因,为探索中华按蚊溴氰菊酯抗性形成的分子机制并进一步制定相应的抗性治理措施打下基础。本研究分三个部分:一中华按蚊溴氰菊酯抗性水平检测与分析为检测不同地区中华按蚊对溴氰菊酯的抗性水平,本研究采用美国疾病预防控制中心(CDC)推荐的生物瓶测定法分别对实验室驯化和3个江苏现场(常州、盐城、泰州)采集的中华按蚊种群的溴氰菊酯抗性水平进行检测,并对不同地区现场中华按蚊样本溴氰菊酯抗性程度进行区分。抗性测定结果显示实验室按蚊在接触溴氰菊酯诊断浓度下(12.5μg/bottle)诊断时间内(30min)死亡率为100%,证明实验室驯化的中华按蚊种群为溴氰菊酯敏感种群。结合不同浓度下蚊虫死亡率并通过数据拟合得到实验室中华按蚊溴氰菊酯半数致死浓度(LC_(50))为3.849μg/bottle。现场采集的按蚊种群中盐城市中华按蚊样本在125、250、375μg/bottle浓度下死亡率分别为11.11%、46.67%、100%,常州市中华按蚊样本在375、500、625μg/bottle浓度下死亡率分别为34.48%、46.43%、100%,泰州市中华按蚊样本在375、500、625μg/bottle浓度下死亡率分别为21.88%、40.83%、84.21%。本部分研究内容发现实验室中华按蚊为溴氰菊酯敏感按蚊,而现场中环按蚊则均为抗性按蚊,且现场中华按蚊溴氰菊酯抗性水平均为高度抗性。但不同地区现场中华按蚊溴氰菊酯抗性水平存在明显差异,抗性水平从高到低依次为泰州市、常州市、盐城市。二中华按蚊溴氰菊酯抗性相关基因检测与分析为分析中华按蚊溴氰菊酯抗性的分子机制,首先采用Allglo探针实时荧光定量PCR法对3个现场中华按蚊样本kdr基因突变情况进行检测,结果显示存在L1014F和L1014C两种kdr突变类型,基因型包括TTT/TTT,TGT/TGT,TTG/TTT,TTT/TGT,无野生纯合型TTG/TTG以及杂合型TTG/TGT,统计分析发现3个现场中华按蚊样本不同kdr等位基因频率以及L1014F和L1014C两种基因突变频率均无统计学差异,提示3个现场中华按蚊样本溴氰菊酯抗性与kdr突变有关,但相互之间抗性水平的差异可能不是由kdr基因突变造成。其次,采用反转录实时定量PCR技术(RT-qPCR)对3个现场中华按蚊样的6个相关CYP基因(CYP6M3、CYP6Y1、CYP6P5、CYP4H14、CYP4G17、CYP12F16)表达水平进行检测,统计分析发现除CYP4G17基因外其他CYP基因表达水平均是现场按蚊高于实验室按蚊,且溴氰菊酯抗性水平更高地区的中华按蚊,其体内CYP6M3基因表达水平也越高。本部分研究内容发现实验室中华按蚊kdr基因型均为野生纯合型,而现场按蚊均为突变型,且不同地区中华按蚊kdr基因突变情况无显著性差异,因而我们认为中华按蚊溴氰菊酯抗性与kdr突变有关,但抗性差异并非由kdr突变造成。在对抗性相关CYP基因表达检测中发现CYP6M3基因表达水平与抗性水平显著相关,推测其可能是抗性主效基因。三中华按蚊溴氰菊酯抗性相关CYP基因表达特征分析为了进一步研究溴氰菊酯抗性相关CYP基因在中华按蚊体内的表达特征,分别对实验室按蚊不同发育时期:卵、幼虫、蛹、成蚊(雌蚊、雄蚊);不同组织:唾液腺、马氏管、中肠、卵巢以及脂肪体;不同溴氰菊酯接触剂量:0、1.25、3.75、6.25、12.5μg/bottle;以及不同溴氰菊酯接触时间:0、5、15、30、60分钟这4种情况下抗性相关CYP基因表达水平进行检测。研究发现,CYP6M3与CYP6Y1基因在雄性成蚊体内的表达量最高;相关CYP基因在中华按蚊不同组织内表达差异显著,表现出明显的富集性;CYP6M3基因与CYP12F16基因在马氏管内表达量分别是卵巢的38.9倍和4.4倍,CYP6Y1基因与CYP4G17基因在脂肪体内表达量分别是卵巢的9.1倍与4.6倍,CYP6P5基因在中肠内表达量是卵巢的30.3倍;接触不同溴氰菊酯剂量和时间对相关CYP基因的表达水平表现出一定的诱导效应,在接触不同溴氰菊酯剂量过程中,CYP6P5、CYPH14与CYP12F16基因随着接触剂量的增大表达水平逐渐增高,CYP6Y1基因表达水平先升高然后降低,CYP4G17基因表达水平先降低随后升高;在接触溴氰菊酯不同时间的过程中,抗性相关CYP基因表达水平变化随时间(5-60min)变化多数呈现出先升高后下降的趋势,且大多数基因表达水平均在30min处达到最大值。本部分研究内容发现抗性相关CYP基因在中华按蚊不同发育时期以及不同组织内表达差异显著,且其表达水平在一些组织中表现出明显的富集性。抗性相关CYP基因表达水平随杀虫剂接触呈现一定的诱导效应,这些都进一步提示CYP家族成员在中华按蚊溴氰菊酯抗性中发挥重要作用。
【学位单位】：江苏省血吸虫病防治研究所
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R384.1
【部分图文】：

氰菊酯抗性的水平，为抗性机制的研究奠定基础，本研究采用美国 CDC 生测定法对实验室和现场中华按蚊样本溴氰菊酯抗性水平进行检测。材料与方法 实验材料1 实验室中华按蚊样本：为江苏省血吸虫病防治研究所媒介生物学实验室饲养品系，该实验室品系为江苏无锡现场采集并传代至今，在饲养过程中从触过杀虫剂。2 现场中华按蚊样本：2017 年分别采集于江苏省盐城市（盐都区大纵湖镇村）、常州市（金坛区朱林镇西洋圩村）和泰州市（高港区大泗镇前进村）个地区的稻田以及水渠（图 1-1），将采集的 3 龄、4 龄中华按蚊幼虫以及蚊回实验室饲养羽化至成蚊。

第一部分 中华按蚊溴氰菊酯抗性水平检测与分析（3）生物瓶的制备与保存：将储备液稀释至所需浓度，然后准备五个干燥好的玻璃瓶，一个作为对照瓶，四个作为重复瓶，将每个瓶身与瓶盖作对应标记，向对照瓶中加入 1ml 无水乙醇，盖好盖子，在其他四个测试瓶中，加入 1ml 溴氰菊酯溶液，旋转玻璃瓶使溶液覆盖玻璃瓶底部，倒转玻璃瓶并旋转以覆盖瓶盖的内部，将瓶身平放，轻轻旋转瓶体，使溶液覆盖瓶壁，所有对照瓶和测试瓶均进行此操作，然后取下瓶盖，继续滚动玻璃瓶，直到液体消失至玻璃瓶完全干透，将玻璃瓶放在桌面上，盖上遮光纸以保护其免受光照，待溶液完全干燥后避光保存备用（图 1-2）。

虫进入生物瓶后将使瓶身平放，启动计时器，立刻检查瓶内蚊在观测过程中，不断滚动瓶身并在标准记录表要求时刻（分别为45，60，75，90，105，120 分钟）记录蚊虫死亡数等数据。成身体翻转、侧歪不能运动或四肢可以轻微颤动。据检测结果计算蚊虫死亡率，根据蚊虫死亡率测定蚊虫抗性水对照瓶中 2 小时的蚊虫死亡率在 3％至 10％之间，使用 Abbo结果。如果在测试结束时对照瓶中的死亡率>10％，则放弃实在推荐诊断时间内死亡率 98％-100％表示蚊虫对杀虫剂敏感内死亡率 80％-97％表明有杀虫剂抗性的可能性，推荐诊断时表明蚊虫存在杀虫剂抗性。bbott 校正公式.校正死亡率(%) =[测试瓶死亡率(%) 对照瓶死亡率(%)]100% 对照瓶死亡率(%)× 100%
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 邱志敏;郑立星;谢汉国;;厦门中华按蚊吸血活动规律及嗜血习性的调查[J];中国人兽共患病学报;2010年01期

2 ;广西中华按蚊实验室养殖研究课题[J];广西预防医学;2005年01期

3 姚立农,潘平涛,季学,杨文康;浙江省海宁市中华按蚊传疟作用调查[J];实用寄生虫病杂志;2002年02期

4 李凤文,王槐芳,李玉英,李锦辉,郭传坤,唐进洪;中华按蚊实验室养殖技术[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;1999年06期

5 康杨,魏红雨,许国君,康万民;中华按蚊幼虫出现绿色个体实验室观察[J];四川动物;1999年04期

6 赵玉强,甄天民;不同温度下中华按蚊卵活力的实验研究[J];中国寄生虫病防治杂志;1997年04期

7 马建设,代汉英,张克仁;中华按蚊耐干旱实验研究[J];医学动物防制;1994年01期

8 徐保海,郑祖杰,何秀华,刘庆生,吴金友,何荣斌,黄柏芳,吴金俊;中华按蚊叮人率三种调查方法的结果比较[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;1995年01期

9 丁德峻,张旭晖,赵勇进;温度对我国中华按蚊世代分布及其传疟有效季节的影响[J];生态学杂志;1991年04期

10 孙延昌,王玮;中国中华按蚊不同地理株间的比较研究进展[J];昆虫知识;1993年01期

相关博士学位论文 前5条

1 冯欣宇;microRNA在我国主要传疟媒介按蚊发育及对疟原虫易感性中作用的研究[D];中国疾病预防控制中心;2018年

2 马雅军;我国赫坎按蚊复合体部分种类的分子鉴别及中华按蚊种群遗传多态性研究[D];陕西师范大学;1998年

3 朱国鼎;中华按蚊拟除虫菊酯杀虫剂抗性研究[D];苏州大学;2014年

4 刘小波;河南省永城市中华按蚊生态习性及飞行距离研究[D];中国疾病预防控制中心;2012年

5 常雪莲;中华按蚊抗药性及种群遗传研究[D];南京医科大学;2014年

相关硕士学位论文 前10条

1 卫沫;中华按蚊细胞色素P450超基因家族溴氰菊酯抗性相关主效基因研究[D];江苏省血吸虫病防治研究所;2018年

2 裴迪;中华按蚊触角转录本表达的研究[D];国防科学技术大学;2016年

3 罗世惠;中华按蚊气味受体基因的全基因组鉴定及组织表达分析[D];重庆师范大学;2017年

4 丁俊;辽宁省疟疾媒介按蚊生态习性及相关影响因素研究[D];中国疾病预防控制中心;2012年

5 尚晓鹏;湖北地区主要传疟媒介按蚊密度、生态习性及抗药性调查研究[D];武汉科技大学;2012年

6 黄朝晖;三种蚊虫COⅡ基因的克隆与序列分析[D];浙江大学;2001年

7 朱国鼎;中华按蚊和嗜人按蚊对间日疟原虫的易感性研究[D];江苏省血吸虫病防治研究所;2007年

8 王琰;中华按蚊线粒体基因组进化及抗药性相关基因多态性研究[D];第二军医大学;2015年

9 张亚晶;中华按蚊防御素基因的克隆、鉴定及转基因体系的初步建立[D];第一军医大学;2006年

10 阎晓宇;中华按蚊防御素基因的克隆、表达及重组蛋白的纯化与生物活性的初步评价[D];第一军医大学;2005年

本文编号：2870570