日本血吸虫TAP基因的免疫保护性及生长发育功能研究

发布时间：2020-11-05 00:39

　　 目的:日本血吸虫酪氨酸3-/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白基因(Schistosoma japonicum tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein,SjTAP),已知可能是具有抗血吸虫感染的免疫保护性基因;同时,SjTAP是在与钉螺组织共培养日本血吸虫母胞蚴体内呈差异性上调表达的基因,还可能是影响母胞蚴生长发育的关键基因。本课题在此基础上,对TAP蛋白在日本血吸虫成虫和母胞蚴体内的组织学分布进行了定位,并进一步研究其抗血吸虫感染的免疫保护性作用,及其在钉螺头足部组织浸出液共培养体系中对日本血吸虫母胞蚴生长发育的调控作用及机制。方法:利用分子生物学方法,构建PET28a(+)-SjTAP重组表达质粒,大量诱导表达并纯化重组TAP蛋白;以重组TAP蛋白免疫小鼠制备免疫血清。免疫荧光组织化学染色法检测TAP在日本血吸虫成虫和母胞蚴体内的组织分布与定位;重组TAP蛋白定期免疫小鼠6周后血吸虫尾蚴攻击感染,42天后统计各组小鼠的虫荷数和每克肝脏的虫卵负荷,计算减虫率与减卵率,评价SjTAP的免疫保护性效果。实时荧光定量PCR(real-timePCR)检测与钉螺头足部组织浸出液(protein extracts of O.hupensis head-foot tissue,PHF)共培养第1、3、4、8天母胞蚴TAP mRNA的表达水平;设计SjTAP特异性siRNA,浸泡法饲喂培养的日本血吸虫母胞蚴,real-time PCR检测RNAi干扰后母胞蚴体内TAP的表达水平,同时观察和测量母胞蚴体长、体宽和体积等生长发育指标变化及其存活率;添加钉螺头足部组织浸出液,RNAi干扰后,real-time PCR及免疫荧光组织化学染色法分别检测各组母胞蚴体内TAP基因和蛋白的表达水平变化,并观察和测量各组母胞蚴的生长发育变化及存活率情况。结果:成功构建了含774bpSjTAP的PET28a(+)-SjTAP重组表达质粒,获得35kDaTAP重组表达蛋白。免疫荧光组织化学染色结果显示TAP蛋白特异性红色荧光颗粒广泛分布于日本血吸虫雌、雄成虫的皮层、皮下层、肌层和实质层,其中,在雌虫的皮层及卵巢周围、雄虫的皮层和皮下层,TAP荧光颗粒呈明显线状分布,在其它部位组织中则呈弥散性分布,仅局部组织有增强。重组TAP蛋白的免疫保护性实验结果显示:免疫组的减虫率为39.9%,减卵率为71.8%;佐剂对照组减虫率为10.8%,减卵率为59.7%;二者组间差异均具有显著性(p0.05),表明TAP重组蛋白对血吸虫感染具有一定的免疫保护性。Real-time PCR结果显示:与对照组比较,与钉螺头足部组织浸出液共培养组母胞蚴TAP基因mRNA的表达水平,从培养第3天开始显著上升,在培养第3、4和8天分别上升6.64倍、2.64倍和6.27倍(p0.01)。免疫荧光组织化学染色结果显示TAP蛋白主要表达在母胞蚴的体壁和胞质中。RNAi干扰实验结果显示,30nM的SjTAP siRNA即可显著抑制母胞蚴TAP基因的表达,使其mRNA表达水平降低93.45%。干扰第6天,SjTAPsiRNA组(siTAP)母胞蚴体长、体宽、体积和存活率分别为 87.23±6.29μm、47.52±3.15μm、128276.36±26920.07μm3 和89.2%,与 siRNA 对照组(sictrl)虫体体长 112.45±11.6μm、体宽 46.74±3.13μm、体积169004.73±40326.01μm3和98%存活率相比较,siTAP组母胞蚴体长明显缩短、体积变小、存活率降低(p0.05)。添加钉螺头足部组织浸出液后,实验分为四组:sictrl、siRNA对照组+1%钉螺头足部组织浸出液共培养组(sictrl+1%PHF)、siTAP、SjTAP、siRNA+1%钉螺头足部组织浸出液共培养组(siTAP+l%PHF);在培养第6天,sictrl+l%PHF共培养组母胞蚴的TAP mRNA表达水平较sictrl组显著升高(p0.05);以TAPsiRNA沉默TAP基因后,siTAP+l%PHF组母胞蚴的TAP mRNA表达水平与sictrl+l%PHF组母胞蚴比较明显下降(p0.05);免疫荧光组织化学染色结果显示四组母胞蚴体内TAP的荧光表达强度与其mRNA水平一致。光镜下,在培养第6天,siTAP组母胞蚴与sictrl组比较,其体长、体宽、体积均均明显减少,存活率显著降低(p0.05);sictrl+l%PHF与 sictrl 组、sictrl+l%PHF 与 siTAP+l%PHF 组、siTAP+l%PHF 与 siTAP 组两两比较,前者母胞蚴的体长、体宽和体积等均值明显较大(p0.05),虫体存活率也较高(p0.05)。结论:成功构建了SjTAP的重组表达质粒,表达获得了35KD的TAP重组蛋白。在日本血吸虫成虫体内,TAP蛋白主要表达于雌雄成虫的皮层、皮下层、肌层和实质层,在皮层呈线性分布,其它部位呈弥散性分布;重组TAP蛋白具有一定的抗血吸虫感染的免疫保护性作用。在日本血吸虫母胞蚴体内,TAP蛋白主要表达于其体壁和胞质中,且随培养时间的延长体壁上的表达量逐渐增加;TAP基因具有促进母胞蚴的生长发育和存活作用;与钉螺组织共培养体系中,钉螺头足部组织浸出液是通过上调母胞蚴TAP基因的表达,进而发挥其促进母胞蚴生长发育与生存能力的作用。
【学位单位】：武汉大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R383.24
【部分图文】：

图４?ＰＥＴ２８ａ（＋）－没７：４尸Ｍ：ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ２０００；?１－Ｆｉｇ．４?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＴＡＭ：ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ２０００；ｌａｎｅ?ｌ－１

随机选取１６个ＢＬ２１单克隆菌株进行ＰＣＲ筛选（图４）。结果显示除第??９和１１号样本外，其他样本均在７７４ｂｐ位置出现目标条带。将测序的基因序列??与ＴＩＰ的ＯＲＦ序列进行ＢＬＡＳＴ对比，结果如图５。二者序列完全一致，表明??阳性克隆成功。??Ｍ?１?２??ＤＬ２０００ｂｐ?图?３?Ｍ戶和?ＰＥＴ２８ａ（＋）双酶切图??Ｍ：ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ２０００；??１：?Ｍ尸汉酶切片段；??２０００?２：?ＰＥＴ２８ｃｘ（＋）双酶切片段??Ｆｉｇ．３?ＴＡＰ?ａｎｄ?ＰＥＴ２８ａ（＋）?ｄｉｇｅｓｔｅｄ?ｂｙ?ＢａｍＨＩａｎｄ?Ｍｉｎｄｌｌｌ??５００?Ｍ：ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ２０００；??２５〇?１：?ＴＡＰ?ｄｉｇｅｓｔｅｄ?ｂｙ?ＢａｍＨ?Ｉ?ａｎｄ?Ｈｉｎｄｌｌｌ；??１００?２：?ＰＥＴ２８ａ（＋）?ｄｉｇｅｓｔｅｄ?ｂｙ?ＢａｍＨ?ｌａｎｄ?Ｈｉｎｄｌｌｌ??Ｍａｒｋｅｒ?１?２?３?４?５?６?７?８?９?１０?１１?１２?１３?１４?１５?１６??图４?ＰＥＴ２８ａ

４．重组ＴＡＰ蛋白的诱导表达及鉴定??ＴＡＰ重组蛋白的小量诱导表达：重组菌液在３７°Ｃ、ＩｍＭ的ＩＰＴＧ中诱导表??达约４ｈ，?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测ＴＡＰ的表达量。结果见图６，与未诱导菌液相比，加??入ＩＰＴＧ诱导后，在诱导全菌及细菌裂解液沉淀中都出现２５ｋＤａ、３５ｋＤａ特异性??蛋白条带，而细菌裂解上清液中没有出现相应条带，推测ＴＡＰ重组蛋白不是分??泌型蛋白，不能分泌表达，而是以包涵体形式在细菌中表达。??ＴＡＰ重组蛋白的大量诱导表达及纯化：在ＢＬ２１菌中大量诱导表达ＴＡＰ重组蛋??白，将菌体沉淀经超声破碎处理后，获得粗制包涵体，用组氨酸标签磁珠对目的??蛋白进行纯化，纯化蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ胶鉴定结果如图７所示，在预测３５ｋＤ处有重??组蛋白条带。??重组ＴＡＰ蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ鉴定：将经ＩＰＴＧ诱导后产生的蛋白纯化后??进行免疫印迹鉴定，由图７可知诱导后细菌表达重组目的蛋白，经纯化后获得较??好纯度的重组目的蛋白。??ｋＤａ?Ｍ?１?２?３?４?ｋＤａ??图６重组ＴＡＰ蛋白的小量诱导表达?图７重组ＴＡＰ蛋白的大量诱导表达纯化??Ｍ：?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｍａｒｋｅｒ；?Ｍ：?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｍａｒｋｅｒ；??丨：束诱导对照；?１：磁
【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 孟峻;侯艳军;张永梅;呼格吉乐;刘洋;宿瑞俊;;小鼠卵母细胞中14-3-3蛋白亚型的表达[J];生殖医学杂志;2015年12期

2 陈兵;文建凡;;血吸虫的寄生适应性研究及其应用价值[J];中国血吸虫病防治杂志;2014年01期

3 张宁;李文桂;向进平;;日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj14-3-3)疫苗免疫BALB/c小鼠诱导免疫应答的动态检测[J];细胞与分子免疫学杂志;2013年07期

4 刘镕;钟沁萍;蒋明森;董惠芬;;一种获得高纯度包涵体蛋白的简便方法[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;2011年05期

5 吕德官;陈临溪;;蛋白14-3-3蛋白亚型与癌症[J];国际病理科学与临床杂志;2011年05期

6 刘文;徐振山;宋礼华;;日本血吸虫GST蛋白和14-3-3蛋白的研究进展[J];生物学杂志;2011年03期

7 蒋就喜;房修罗;胡婷婷;;日本血吸虫rSj14-3-3疫苗对小鼠抗病免疫效应的研究[J];中国血吸虫病防治杂志;2010年05期

8 陈美红;黄欧平;何明;汪利群;;14-3-3β蛋白mRNA在宫颈癌及宫颈上皮内瘤样变的表达[J];中国妇幼保健;2010年04期

9 刘庆中;胡元生;沈继龙;江宝玲;汪学龙;;重组日本血吸虫信号蛋白14-3-3不同剂量对免疫保护性的影响[J];中华预防医学杂志;2006年04期

10 朱鹏程,桑瑛颖,徐人尔,赵璟,李昌本,赵寿元;ADAM22蛋白与14-3-3β蛋白之间的相互作用[J];中国科学(C辑:生命科学);2002年03期

相关硕士学位论文 前1条

1 熊雅念;日本血吸虫表膜蛋白dysferlin和myoferlin的初步研究[D];中国农业科学院;2013年

本文编号：2870846