多重耐药的鲍曼不动杆菌是一种革兰阴性杆菌,它是医院感染的重要病原菌,常常会引起广泛的院内感染;其中最常见的是肺炎、下呼吸道感染、泌尿系统感染和脑膜炎。多重耐药鲍曼不动杆菌菌株的流行病学调查发现,其在院内感染的感染率是逐年增加的。多重耐药的鲍曼不动杆菌在医院环境中分布广泛,并且可以长期存活,这对于住院患者来说尤其是危重症患者的威胁很大。多重耐药的鲍曼不动杆菌,还常常会引起院内感染的大爆发,尤其是在各家医院的重症监护室;这已经引起了临床医生的高度警惕和广泛关注。迅速崛起的多重耐药鲍曼不动杆菌导致了临床治疗手段的匮乏。多重耐药致病菌株对于目前临床应用的多种类型的抗菌药物中,至少有三类或三类以上都是耐药的。最初,多重耐药致病菌株的感染仅仅局限于院内感染,但是目前多重耐药的病原菌常常长期定植在易受攻击的患者(包括存在基础疾病的患者、免疫力低下的患者等)体内;更为严峻的是,这些多重耐药致病菌株出现了社区流行;鲍曼不动杆菌最近已被列入六大最危险的机会致病菌之一。鲍曼不动杆菌可以在多种不利的环境中长期存活,包括不利的外环境和内环境下宿主的免疫攻击;这主要是由于细菌生物被膜的形成;这也是鲍曼不动杆菌在人体组织慢性定植以及在医疗器械表面持续存在的重要条件。在传统意义上,人们常常认为细菌的生物被膜是一团细菌的组合、堆叠,是细菌的菌落不可逆的粘附在医疗器械或者生物体的表面;近期,一些学者通过蛋白质组学分析以及基因转录组学研究发现,细菌生物被膜不单单只是浮游细菌的简单混合物,而是一种特殊的生长时期或者状态;不同于浮游细菌状态,它们有着自己独特的蛋白质表型和基因表达。多重耐药的鲍曼不动杆菌形成生物被膜的能力已经成为评估其致病力的主要因素之一。细菌的生物被膜,是由多个菌落聚合形成的动态稳定整体;是多个相互关联的菌落包埋入大量细胞外基质中(包括细胞外多糖、细胞外遗传物质、蛋白质和脂类)所组成。细菌的慢性定植、难以清除、引起慢性感染和感染反复发生,都依赖于菌体生物被膜的生成和维持。细菌菌体在生物被膜的持续保护下,可以长期生存,具有更强的耐药性和致病力;这是目前临床治疗亟待解决的难题。我们认为,细菌生物被膜的形成和形态的维持是通过特殊的通路以及信号因子、转录因子所调节的。因此,通过本试验的研究,我们探讨,细菌处于生物被膜状态下,对细菌菌体致病力及耐药性的变化和影响;应用转录组学研究细菌菌体生物被膜的基因独特表达,探寻生物被膜生成和形态维持的基因表达变化。第一部分多重耐药鲍曼不动杆菌感染趋势研究目的:多重耐药的鲍曼不动杆菌常常引起广泛的院内感染。多重耐药的鲍曼不动杆菌流行病学调查发现,其在院内的感染率是逐年增加的。我们研究多重耐药鲍曼不动杆菌的感染趋势,提取菌株遗传物质进行亚型分析,分析菌株亚型的感染趋势特点,制备不同生长状态下的多重耐药鲍曼不动杆菌菌株模型。方法:1多重耐药菌株病原菌感染趋势调查研究,调查我院2011-2015年间,多重耐药菌株的感染学趋势。2筛选我院2011-2015年间多重耐药菌株中的多重耐药鲍曼不动杆菌菌株进行研究。筛选多重耐药鲍曼不动杆菌,进行重复序列聚合酶链反应分型,分析多重耐药鲍曼不动杆菌不同亚型的感染趋势。3选取多重耐药鲍曼不动杆菌优势菌株,制备优势菌株不同生长状态下的样本,包括快速生长期和生物被膜固着期的菌株样本,以进行进一步的研究。结果:1多重耐药病原菌的感染趋势调查发现,检出多重耐药菌株以及其中多重耐药的鲍曼不动杆菌分别呈逐年递增趋势,增长速率分别为1.1067和1.2287。2选取2015年一年时间内,我院筛选的多重耐药鲍曼不动杆菌608例,提取全部已经收集的多重耐药鲍曼不动杆菌菌株遗传物质,进行重复序列聚合酶链反应分型,总共分为7个亚型。其中,第5类亚型菌株数量最多,视为优势菌株,以其作为研究对象,进行后续进一步研究。3观察优势多重耐药鲍曼不动杆菌野生菌株生物被膜的生长情况。结论:多重耐药病原菌感染趋势调查研究发现,检出的多重耐药菌株以及其中多重耐药的鲍曼不动杆菌分别呈逐年递增趋势。多重耐药菌株的感染越来越多,敏感的可以治疗的抗菌药物越来越少,成为临床亟待解决的难题。第二部分多重耐药鲍曼不动杆菌高通量测序分析生物被膜状态的基因表达变化目的:生物被膜不只是细菌简单黏附的混合物,而是另一种特殊的生长状态;与浮游状态下细菌相比,它们有着自己独特的蛋白质表型和基因表达。我们比较研究同一菌株,在不同生长状态下的基因表达分析对比,比较同一菌株在不同生长状态下基因表达差异,揭示多重耐药菌株在生物被膜阶段独特的基因表达,探讨生物被膜生成和形态维持的相应的基因表达变化。方法:1提取研究优势鲍曼不动杆菌菌株,快速生长期及生物被膜固着期的遗传物质,对其进行质和量的检测。2分别对研究菌株的快速生长期及生物被膜固着期两个状态,进行遗传物质高通量测序分析,研究基因表达。3将研究菌株两种不同生长状态下(快速生长期和生物被膜固着期)的检测基因序列,与公共数据库比对,进行基因功能注释。4研究同一菌株不同生长状态下的基因序列表达,进行基因表达差异的统计学分析比对。结果:1对比不同生长状态下的同一菌株,快速生长期和生物被膜固着期的多重耐药鲍曼不动杆菌,研究菌株的基因表达差异。研究数据表明,筛选研究的多重耐药鲍曼不动杆菌菌株中,第5类亚型菌株数量最多,也就是Acinetobacter baumannii BJAB0868分布最多,视为优势菌株,作为研究对象进行进一步的研究。2分析多重耐药鲍曼不动杆菌菌株不同生长时期的基因表达发现,两个样本共同表达最多的基因,主要为氨基酸的运输和代谢相关基因,能量的生成和转换相关基因,无机离子的运输和代谢的相关基因,碳水化合物的运输和代谢的相关基因,酶的运输和代谢的相关基因,菌体细胞壁生成的相关基因等维持微生物体生命活动所必须的、维持合成菌体细胞结构所必须的、维持菌体生命活动正常运转所必须的基因。3比较研究多重耐药鲍曼不动杆菌优势菌株Acinetobacter baumannii BJAB0868不同生长时期的两个样本,进行转录组高通量测序分析,比对两个样本基因序列的表达发现,两种状态下菌株的基因表达,确实存在显著差异。相对于快速生长期,生物被膜状态的菌体有106个基因出现了表达上调,92个基因出现了表达下调。在表达上调的106个基因中,有53个基因的表达在细菌生物被膜状态是显著升高的,但在浮游细菌快速生长期状态下,表达是极少的甚至是完全被抑制表达的。高通量测序基因表达,比对公共数据库,进行基因功能注释,我们发现,这53个表达显著差异的基因,可能部分参与细菌生物被膜生成和形态维持。结论:我们将多重耐药的鲍曼不动杆菌优势菌株Acinetobacter baumannii BJAB0868不同生长状态下的两个样本,进行了高通量测序基因表达的比对分析,比较基因的表达差异。通过系统的基因表达的比较和统计学分析比对,发现二者之间存在着基因表达的差异。细菌生物被膜确实是细菌的另外一种独特的存在形式,具有其自身独特的基因表达特点。表达差异的基因,部分基因与细菌生物被膜的生成和形态维持相关。通过与公共数据库比对,进行表达差异基因的功能注释分析,我们发现表达差异的基因,还可能参与导致了细菌致病力和耐药力的增加的调节。第三部分多重耐药鲍曼不动杆菌基因敲除研究菌株生物被膜状态对其致病力影响目的:生物被膜状态下的细菌,有着自己独特的基因表达,部分表达显著差异的基因,在浮游细菌状态下基因的表达是被抑制的。选取其中表达差异的目标基因TetR family transctiptional regulator,在本试验前期研究中发现,在细菌生物被膜状态下,该目标基因表达是明显升高的;而在细菌快速生长期浮游状态下,该基因的表达却是被抑制的。我们认为它可能参与了生物被膜的生成和形态维持过程。选取该基因作为目标基因,进行基因敲除,构建突变菌株,研究在该基因缺失的情况下,是否对细菌生物被膜的生成和形态维持,造成显著影响。进而,进一步探讨细菌在生物被膜生成能力缺失或不健全的情况下,与野生菌株相对比,造成大鼠肺部急性感染及慢性感染的致病力如何变化,分析生物被膜生成对细菌致病力的影响。方法:1将Acinetobacter baumannii BJAB0868菌株,不同时期表达显著差异基因TetR family transctiptional regulator,进行基因表达的测定,再次验证其是否存在表达差异。2对研究对象,多重耐药的鲍曼不动杆菌Acinetobacter baumannii BJAB0868,进行目标基因TetR family transctiptional regulator的敲除。在研究菌株的基因组上扩增目标基因的上、下游同源重组手臂。通过融合PCR技术连接获得基因敲除用的打靶片段。将其克隆入自杀载体p UC19,获得pUC19/TetR质粒。提取质粒,采用反向PCR技术从pUC19/TetR质粒上,删除目标基因序列,扩增序列经酶切,连接获得pUC19-ΔTetR目标基因质粒。在此质粒的上下游打靶手臂连接位点处插入来自于pKD4质粒的kan抗性基因,获得pUC19-ΔTetR::Kan质粒。将打靶片段(上游同源手臂-抗性基因-下游同源手臂)从p UC19-ΔTetR::Kan质粒上切下,亚克隆入pCVD442自杀质粒,获得打靶质粒pCVD442-ΔTetR::Kan。通过电转化,将打靶质粒pCVD442-ΔTetR::Kan转入大肠杆菌E.coliβ21552,获得供体菌β21552/pCVD442-ΔTet R::Kan。打靶片段(融合PCR产物)经供体菌β21552/pCVD442-ΔTetR::Kan与受体菌Acinetobacter baumannii BJAB0868进行接合试验,在无菌LB平板上筛选获得抗性的BJAB0868菌株克隆,称为BJAB0868/pCVD442-ΔTetR。在LB平板上,划线接种BJAB0868/pCVD442-ΔTetR,培养至单个菌落形成,通过PCR技术筛选获得TetR基因被删除的克隆,局部序列经测序验证成功,命名为BJAB0868/ΔTetR。3 LB平板筛选转化突变的克隆,经过PCR试验及基因测序证实,此突变菌株可以稳定遗传相关基因。4突变菌株BJAB0868/ΔTetR,研究和评估其生成生物被膜的能力和对各类抗菌药物的耐药性。5动物实验研究野生菌株及突变菌株对大鼠急性肺部感染及慢性肺部感染的致病力影响,进而评估细菌在生物被膜生成能力缺失或不健全的情况下,造成大鼠急性感染及慢性感染的致病力如何变化。结果:1对目标基因TetR family transctiptional regulator,再次进行基因表达浓度的测定,发现在生物被膜状态下该基因的表达是显著升高的,与浮游菌状态相比,存在显著差异。2目标基因敲除,构建稳定遗传的突变菌株BJAB0868/ΔTetR。研究发现突变菌株,生成生物被膜能力明显降低。电镜观察发现,突变菌株生成的生物被膜不完整,厚度变薄,面积也明显变小。3突变菌株BJAB0868/ΔTetR的耐药性并没有明显变化,在敲除目标基因后,突变菌株耐各类抗菌药物的能力并没有受到显著影响。4动物实验研究野生菌株及突变菌株的致病力引起大鼠急性肺部感染及慢性肺部感染的比较研究,肺部灌洗液细菌定量培养表明,感染突变菌株BJAB0868/ΔTetR组定量培养菌株数量明显低于感染野生菌株组。大鼠肺部感染病理切片研究显示,感染突变菌株BJAB0868/ΔTetR组肺部炎症明显轻于感染野生菌株组。结论:目标基因TetR family transctiptional regulator,在细菌生物被膜状态下,表达显著升高,它确实参与了生物被膜的生成和形态维持过程。我们将目标基因敲除,构建稳定遗传的突变菌株BJAB0868/ΔTetR。目标基因敲除后的突变菌株,虽然对多种抗菌药物的耐药性没有明显变化,但生物被膜生成能力显著降低。突变菌株BJAB0868/ΔTetR在失去生物被膜保护的情况下,面对宿主的免疫攻击和抗菌药物的杀灭,更加容易被清除。失去了生物被膜的保护,突变菌株的致病力显著下降。细菌在生物被膜状态下,缘于生物被膜持续有力的保护,其致病力是显著增加的。生物被膜的保护,可以让菌株免受宿主免疫力的攻击及各类抗菌药物的杀灭,保护菌株持续稳定的存在,成为持续的感染源,导致感染的持续加重和反复发生。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R378
【部分图文】：
图 1 我院逐年多重耐药菌株以及多重耐药鲍曼不动杆菌增长趋势Fig.1 The trend of multidrug resistant and multidrug resistant Acinetobacbaumannii in these years
26图 2 鲍曼不动杆菌细菌生物被膜电镜扫描图片netobacter baumannii bacterial biofilm scanning electron
43附 图图1 样本碱基质量分布图Fig.1 The samples base mass distribution.图 2 两个样本共同表达最多的基因统计 GO 分类条形图Fig.2 Two samples co-expressed with the most common statistical GOclassification bar charts
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本文编号：
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