骨质疏松SD大鼠二膦酸盐相关性颌骨骨坏死动物模型的建立和局部风险因素的研究

发布时间：2020-11-06 18:54

　　 第一部分建立骨质疏松SD大鼠动物模型目的:建立安全可靠的骨质疏松SD大鼠动物模型。方法:选用6月龄雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠10只,随机分成两组,每组5只大鼠:模型组行双侧卵巢切除手术,对照组假手术切除卵巢周围近似体积脂肪组织,术后12周处死所有动物,对比体重、全身BMD、血清Ca~(2+)、P~(3+)和ALP浓度手术前后变化情况以及HE染色观察椎体组织形态表现。结果:所有动物在术后12周体重增加,模型组增长更为显著(P0.05);和术前相比,模型组全身BMD和血清Ca~(2+)浓度降低,血清P~(3+)和ALP浓度升高,对照组全身BMD降低,血清Ca~(2+)、P~(3+)和ALP浓度降低,两组变化值均有统计学差异(P0.05);组织形态学结果显示对照组动物椎体骨小梁形态规则结构完整,模型组动物骨小梁明显变细变窄、减少,呈碎片状,骨髓腔间隙大,骨量明显减少。结论:健康6月龄雌性SD大鼠双侧卵巢切除术后12周可以建立稳定可靠的骨质疏松动物模型。第二部分不同局部风险因素建立骨质疏松SD大鼠二膦酸盐相关性颌骨骨坏死动物模型目的:建立骨质疏松SD大鼠二膦酸盐相关性颌骨骨坏死动物模型并研究不同局部风险因素对BRONJ的影响。方法:选择45只6月龄雌性SD大鼠,应用实验一的方法使用双侧卵巢切除术建立骨质疏松动物模型(T0)。术后12周(T1)所有大鼠皮下注射阿仑膦酸钠1.0mg/kg/d,连续给药60天后(T2)随机分成三组:Group1:对照组,不做干预;Group2:ALN+拔牙组,给药结束后拔除双侧上下颌第一磨牙;Group3:ALN+牙周刮治组,给药后第11天用正畸结扎丝结扎双侧上下颌第一磨牙以建立慢性牙周炎模型,给药结束后行牙周刮治术。术后2周(T3)、4周(T4)、8周(T5)分别从三组随机抽取5只大鼠处死。结果:(1)临床表现显示Group1和Group3的发病率无统计学差异,Group2动物BRONJ发病率为100%,明显高于Group1和Group3。其中上颌骨发生率为26.7%(8/30),下颌骨发生率为56.7%(17/30),高于上颌骨。体重变化与BRONJ无明显相关;(2)血清RANKL和OPG浓度随时间发生显著改变,但与BRONJ无明显相关,RANKL/OPG比值在T4时显著降低,差异有统计学意义(P0.05);(3)HE染色观察BRONJ病变区骨小梁结构紊乱,骨细胞溶解导致大量空虚骨陷窝形成(P0.05),TRAP染色发现BRONJ和Non-BRONJ区域相比,破骨细胞数目显著减少(P0.01);(4)根据骨坏死病变和软组织损害程度对所有BRONJ动物进行分级和分期,Group1中1期发生率为1.67%(1/60);Group2中0期发生率为46.67%(28/60),1期发生率为21.67%(13/60),2期的发生率为31.67%(19/60);Group3实验对象中1期发生率为3.33%(2/60),2期的发生率为1.67%(1/60);Group1和Group3发病率和病变程度明显低于Group2,Group2病变程度随着时间变化逐渐加重;(5)Micro CT显示BRONJ病变区域有骨微裂发生,骨质溶解破坏。时间变化对Group1和Group3均无明显影响(P0.05);在T3时,与Group1相比,Group2的BMD、Tb.N和Tb.Sp值有显著性差异(P0.05),Group3的Tb.Th和Tb.Sp值有显著性差异(P0.05),Group2的BMD、BV/TV、BS/BV、Tb.N和Tb.Th值与Group3均有显著性差异(P0.05);T4时,Group1和Group2的Tb.N值有极显著差异(P0.01);T5时,各组间无明显统计学差异(P0.05);Non-BRONJ大鼠与BRONJ大鼠Tb.N差异极为显著(P0.01),但不同分期间无明显差异(P0.05),BMD在BRONJ的不同分期变化差异显著(P0.05),Tb.Th在1期和2期与正常组均有显著差异(P0.05),0期与1期动物Tb.Sp差异显著(P0.05)。结论:使用骨质疏松动物模型高剂量ALN皮下注射持续给药60天后予以拔牙干预,术后2周观察建模成功。BRONJ病变程度与时间有相关性。拔牙是BRONJ的好发因素,牙周刮治对BRONJ的发病率没有显著影响。血清RANKL/OPG比值变化可能与BRONJ有关,但在病变早期不敏感。Tb.N和Tb.Th可能是病变早期与BRONJ相关的骨形态标志,病变区可观察到骨微裂发生。第三部分骨质疏松SD大鼠二膦酸盐相关性颌骨骨坏死骨生物力学研究目的:研究骨质疏松SD大鼠BRONJ病变区骨生物力学特性。方法:将5只按照实验一的方法建立的骨质疏松SD大鼠作为Group A,术后12周按1.0mg/kg/d的剂量皮下注射生理盐水,持续给药60天,然后拔除双侧上下颌第一磨牙,4周后予以处死。将实验二中拔牙组中左侧下颌骨未发现BRONJ病变的大鼠随机抽取5只作为Group B,将实验二中拔牙组中左侧下颌骨发现BRONJ病变的大鼠随机抽取5只作为Group C。取完整左侧下颌骨测量几何形态后行三点弯曲检测研究骨生物力学研究。结果:(1)术后Group A体重明显高于Group B和Group C,差异有统计学意义(P0.05);(2)所有大鼠下颌骨结构的几何形态未发现明显差异(P0.05);(3)Group A最大载荷、最大挠度和屈服挠度明显低于Group B(P0.05),标准斜率明显高于Group B和Group C(P0.05)。与Group B相比,Group C最大挠度显著减少,标准斜率显著升高(P0.05)。结论:ALN能提高OP大鼠的骨组织强度和硬度,BRONJ对下颌骨硬度没有显著影响,但骨强度明显降低,这可能是BRONJ并发病理性骨折的病因之一。
【学位单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R782;R-332;R580
【部分图文】：

至 7.2～7.4，持续搅拌溶解至溶液呈清亮，再加入 500ml 0.1mol/L PBS 溶液定容至 1000ml，充分混匀后 4℃保存。甲酸脱钙液的配制：将 500ml 无水乙醇缓慢加入 500ml 10％福尔马林溶液，混合充分后再依次加入 150ml 甲酸和 100ml 1％盐酸溶液，充分混匀后室温保存。2.2 实验方法2.2.1 主要技术路线图（见图 1.1）

大鼠手术方法和模型组相同，暴露腹腔后，仅切除卵巢组织附近相同体积的脂肪。术后 6h 大鼠自由摄食、饮水，室温（25±3C°）。予以术后肌注青霉素 20万 U（只·次），一天两次持续 3 天。术后一周予以拆线，同等条件下饲养，自由摄食水，普通饲料喂养。术后 12 周实验动物全身麻醉后取仰卧位固定，开胸暴露心脏，向左心室内注射 1％肝素钠 0.2ml 后经左心室行主动脉插管，血管钳固定后剪开右心耳，先以生理盐水 150ml 快速冲洗血管，然后用 4％多聚甲醛的 0.01mol/L PBS（4℃，PH7.40）250ml 灌注固定，先快后慢，之后取大鼠椎体，置 4％多聚甲醛固定液后固定，在 4℃冰箱内保存。多聚甲醛进入大鼠体内，大鼠会出现四肢、尾的抽搐，最终以肝脏发白、内脏鼓起即灌注好。将骨组织置于 4％中性多聚甲醛溶液中固定 48 小时，甲酸脱钙液脱钙直至探针可以无阻力刺入为终点，流水冲洗过夜，常规酒度梯度脱水，正丁醇透明，石蜡包埋，切成厚度为 4μm 的切片，HE染色后光学显微镜下观察。

术术 术术0.120.140.160.18**全MBD（/gc注：用单因素 ANOVA 进行分析。同一曲线中模型组与对照组相比，**表示差异极显著（P＜0.01表示差异显著（P＜0.05），不标者则为差异不显著（P＞0.05）。图 1.4 全身 BMD 值3.5 组织病理学检查手术后第 12 周，实验动物椎体 HE 染色显微镜下观察发现，对照组大鼠椎体骨小梁排列规则，连续性好，骨小梁较粗，纵向结构完整，模型组大鼠骨小梁明显变细变窄，骨小梁间隙变宽，骨髓腔间隙变大，骨量明显减少，发生 OP 样改变（见图 1.5）。
【参考文献】

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本文编号：2873535