肠道病毒71型（Enterovirus，EV71）包含单股正链RNA基因组，属于小RNA病毒科（picornavirus family）肠道病毒属成员,其感染婴幼儿后能引起手足口病（hand-foot-mouth disease，HFMD）。EV71基因组长约7.5Kb (kilobase, Kb)，仅由一个开放阅读框构成，编码一个多聚蛋白前体,这个多聚蛋白前体能裂解成四个结构蛋白（VP1、VP2、VP3和VP4），七个非结构蛋白（2A、2B、2C和3A、3B、3C和3D）。虽然有研究表明IFN-I（type I interferon，IFN-I）能保护细胞抵抗EV71的感染，然而EV71并不诱导IFN-I的产生。最近研究发现EV71能够通过阻断RIG-I、干扰素调节因子7（interferon regulated factor7，IRF7）以及I型干扰素受体（IFN-I receptor， IFNAR）的表达来抑制干扰素诱导基因（Interferon-stimulated gene, ISG）的激活。 宿主通过模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）和病原微生物的病原相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）的相互作用来识别病毒和入侵微生物。PRR包括了膜受体和胞质受体。膜受体为Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs），而胞质受体包括NOD样受体（NOD-like receptor，NLRs）以及RLR样受体（（RIG-I-like receptor，RLRs）。RLR样受体包括RIG-I（retinoid acid-inducible gene I, RIG-I）和MDA-5(melanomadifferentiation-associated gene5, MDA-5)。RIG-I和MDA-5都包含CARD结构域(caspase recruitment domains)，结合非帽化的RNA后与同样含有CARD结构域的线粒体抗病毒蛋白（mitochondrial antiviral signaling，MAVS）结合，导致MAVS和IKK激酶（I B kinase）结合，然后以此为平台募集下游不同的信号分子组成不同的调控复合物，最终激活核因子B（nuclear factor-kappaB，NF-B）和干扰素调节因子3（interferon regulated factor，IRF3），进而起始-干扰素（interferon-β，IFN-）的表达及IFN介导的抗病毒免疫。RIG-I信号通路受泛素化、去泛素化、磷酸化以及去磷酸化的调控。前期报道肿瘤抑制因子圆柱瘤基因（Cylindromatosis，CYLD）可以通过调控RIG-I的泛素化参与宿主的先天性免疫应答信号传导途径。在树突状细胞（Dendritic cells, DC）中缺失CYLD会诱导持续泛素化RIG-I，并增强TANK结合激酶1（TANK-binding kinase1，TBK1）和IκB激酶（The IκB kinase，IKK）的活性。除了RIG-I, CYLD同样能去除核因子Kappa B基本调节因子（Nuclear factor-Kappa B essential modulator，NEMO）、IKK、肿瘤坏死因子受体相关因子2（TNF receptor-associated factor2，TRAF2）以及B细胞淋巴瘤蛋白3（B-cell CLL/lymphoma3，Bcl-3）的K63位泛素化来负调控NF-B和c-Jun N末端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）信号通路。这些发现确定了CYLD成为抗病毒先天性免疫应答的关键调控分子。 MicroRNA（miRNA）是一类高度保守的非编码小RNA分子，平均长度为22nt（nucleotide，nt）。miRNA通过与靶基因的3’UTR（untranslational region，UTR）结合来抑制基因表达。miRNA参与调节许多生命进程，发挥重要的作用。近来报道了在单核细胞核巨噬细胞中miRNA参与调控先天性免疫应答，如miR-146a靶向白介素1受体相关激酶1（IL-1R associated kinase1，IRAK1）和肿瘤坏死因子受体相关因子6（TNF receptor associated factor6，TRAF6）来负调控RIG-I样受体（RIG-I-like receptor，RLR）信号通路。然而到目前为止尚未发现关于EV71通过miRNA调控RIG-I信号通路的报道。本研究发现： 1. miR-526a的表达受RNA病毒诱导激活的IRF3/7转录因子的调控：利用荧光定量PCR(quantitative polymerase chain reactin，q-PCR)的方法，发现RNA病毒感染可以显著促进细胞内miR-526a的表达；通过RNA干涉手段，发现IRF3、7敲低细胞中水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）诱导的miR-526a上调被显著抑制，以上结果提示我们miR-526a的表达受RNA病毒诱导激活的IRF3/7转录因子的调控。 2. miR-526a促进RIG-I信号通路的激活：通过合成miR-526a模拟物以及抑制剂，利用IFN-、NF-B以及IRF3报告基因活性检测方法，发现miR-526a模拟物可以显著增强RIG-I信号通路的激活，这种激活活性可以被miR-526a抑制剂阻断；利用q-PCR以及AlphaLISA技术，发现miR-526a能够促进病毒诱导的IFN-的转录和分泌；利用q-PCR方法，发现miR-526a的过表达能够激活IFN-的下游诱导基因ISG56、ISG54、白介素-8（interleukin-8，IL-8）以及趋化因子配体-2（Chemokine (C-X-C motif) ligand2，CXCL-2）的表达，以上结果显示miR-526a是参与调控RIG-I信号通路的正调控因子。 3.miR-526a抑制VSV和NDV病毒的复制：用免疫印迹检测发现miR-526a模拟物能够抑制VSV病毒感染后VSV-G蛋白的表达；以新城疫病毒NDV-GFP（Newcastle Disease Virus，NDV）病毒感染细胞为模型，利用荧光显微镜以及流式细胞术检测方法发现miR-526a模拟物可以显著抑制NDV病毒在细胞内的复制，以上结果提示我们miR-526a可以抑制RNA病毒复制。 4.miR-526a通过靶向CYLD激活RIG-I信号通路：通过生物信息学软件TargetScan等预测，发现CYLD是miR-526a潜在的靶点。检测带有不同位置的CYLD3’UTR荧光素酶报告基因的活性发现CYLD存在miR-526a作用位点；利用q-PCR以及免疫印迹方法，发现miR-526a模拟物能够下调CYLD的转录水平以及蛋白水平。利用细胞泛素化实验，发现miR-526a模拟物可以增强病毒诱导的RIG-I K63位泛素化水平，而miR-526a抑制剂可以抑制病毒诱导的RIG-I的泛素化；利用免疫印迹实验，发现miR-526a模拟物可以增强病毒诱导的IKK/、I B及IRF3的磷酸化，以上实验说明miR-526a通过靶向CYLD增强RIG-I的K63位泛素化修饰，进而激活RIG-I信号通路。 5. EV71病毒利用3C蛋白酶靶向miR-526a抑制RIG-I信号通路的激活：利用q-PCR以及免疫印迹技术，发现EV71病毒感染后下调miR-526a的表达、IRF7的激活以及IFN-的产生，以上表型均由EV71的3C蛋白酶介导；通过免疫印迹技术，发现miR-526a模拟物及CYLD的小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)能够抑制EV71病毒的复制以及EV71VP1蛋白的表达，以上结果说明EV71通过靶向miR-526a阻断RIG-I信号通路的激活。 综上所述，我们发现病毒感染巨噬细胞后能显著上调miR-526a，并依赖IRF3/7的激活。而miR-526a通过靶向CYLD，去除RIG-I的K63位泛素化正调控VSV介导的IRF3和NF-B的激活。进一步发现了EV71的3C蛋白酶能够抑制miR-526a的表达，过表达miR-526a能够抑制EV71的复制。因此本研究第一次发现了miR-526a是RIG-I信号通路的一个正调控因子，并且EV71通过抑制miR-526a来抑制RIG-I介导的IFN-I产生。
【学位单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2014
【中图分类】：R392
【文章目录】：目录
缩略词表
摘要
Abstract
前言
一、EV71 逃逸宿主天然免疫与其致病性
二、RLR 信号通路与抗病毒感染
三、microRNA 参与先天性免疫应答
四、本课题研究的科学问题
材料与方法
1 材料
1.1 细胞株
1.2 菌毒株、质粒与 RNA 合成物
1.3 常用试剂盒
1.4 分子生物学及细胞生物学试剂
1.5 抗体
1.6 其它化学试剂
1.7 主要实验仪器
2 实验方法
2.1 病毒扩增
2.2 病毒感染
2.3 细胞培养
2.4 RNA 提取
2.5 反转录
2.6 荧光定量 PCR
2.7 CYLD 3’UTR luciferase 质粒的构建
2.8 luciferase reporter 检测
2.9 免疫沉淀
3.0 免疫印迹
3.1 流式细胞术检测
3.2 AlphaLISA 检测 IFN- 水平
3.3 统计学分析
结果
1 miR-526a 的表达受 RNA 病毒诱导激活的 IRF3/7 转录因子的调控
2 miR-526a 促进 RIG-I 信号通路的激活
3 miR-526a 抑制 VSV、NDV 及 EV71 病毒的复制
4 miR-526a 通过靶向 CYLD 激活 RIG-I 信号通路
讨论
结论
参考文献
文献综述
摘要
Abstract
参考文献
代表性论文
个人简历
致谢
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 毛理凯,漆安慎;第三次免疫应答的研究[J];北京师范大学学报(自然科学版);2001年02期
2 韩之波,任贺,杨仁池;瘦素与免疫应答[J];国外医学(生理、病理科学与临床分册);2005年03期
3 陈坤;徐红梅;;糖原合酶-3对免疫应答的调节作用[J];中国肿瘤生物治疗杂志;2010年05期
4 蔡访勤;呼吸道的免疫应答[J];国外医学.呼吸系统分册;1982年04期
5 吴振荣,钟学宽,许永丽,周令望,武常莉;低硒儿童的免疫应答[J];哈尔滨医科大学学报;1989年06期
6 Mara Rossini;黄海根;;基因转移小鼠在免疫应答研究中的应用[J];上海实验动物科学;1991年01期
7 涂文伟,杨锡强;细胞因子的免疫应答调控及其临床意义[J];国外医学(儿科学分册);1993年05期
8 朱云娟;旋毛虫和假旋旋毛虫在小鼠引起的免疫应答[J];国外医学(寄生虫病分册);1995年06期
9 Moll H ,詹艳爱 ,朱振勤;对寄生虫免疫应答利与弊的区别[J];国外医学(寄生虫病分册);1997年06期
10 丁洁,吴咸中;一氧化氮与免疫应答[J];中国中西医结合外科杂志;1998年04期
相关博士学位论文 前10条
1 史皆然;胞壁型重组BCG的构建及对小鼠免疫应答的影响[D];中国人民解放军第四军医大学;2003年
2 董生福;人工合成寡糖促进乙型肝炎病毒抗原诱导免疫应答的研究[D];复旦大学;2007年
3 李珣;以DNA为基础的复合免疫接种诱导小鼠抗AMA1免疫应答[D];中国人民解放军第四军医大学;2003年
4 董慧;抗原靶向不同树突细胞亚群诱导抗结核分枝杆菌免疫应答的研究[D];扬州大学;2010年
5 吕翠芳;几类具免疫应答的HIV-1动力学模型研究[D];湖南大学;2014年
6 刘志华;用腺病毒载体介导的基因转移研究HBV/C区热点变异对小鼠免疫应答的影响[D];第一军医大学;2002年
7 林莉;miR-145促进天然免疫应答中巨噬细胞产生白细胞介素10及其表观遗传机制研究[D];浙江大学;2011年
8 刘娟;Rhbdd3分子在免疫应答调控中的作用及其机制研究[D];第二军医大学;2012年
9 卢燕来;人γδT细胞对A型流感病毒血凝素蛋白及假病毒的免疫应答研究[D];北京协和医学院;2011年
10 朱旭辉;DNMT1和CLM-3在天然免疫应答中的功能及机制研究[D];第二军医大学;2013年
相关硕士学位论文 前10条
1 文科;鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白刺激小鼠细胞产生的免疫应答及鞭毛蛋白佐剂效应的初步研究[D];扬州大学;2009年
2 彭臻菲;两性葡聚糖免疫应答与免疫调节机制研究[D];福州大学;2006年
3 李金波;HCV HVR1模拟肽诱导小鼠免疫应答及机制的初步研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2008年
4 岳翔;参与先天性免疫应答的miRNA的鉴定及其功能的初步研究[D];安徽大学;2012年
5 王栋;小鼠胸腺对纳米级化学异物与异种细胞的免疫应答[D];山东大学;2013年
6 曹艳红;具有免疫应答和细胞内部时滞的HIV感染模型的稳定性分析[D];南华大学;2011年
7 赵稳;HIV-1抗原特异性CTL免疫应答影响因素的研究[D];广州医学院;2010年
8 李玉芬;维生素A对小鼠Th1/Th2免疫应答模式平衡影响的研究[D];吉林大学;2004年
9 秦雅楠;Bcr/Abl和hIL-2双基因表达载体的构建和小鼠免疫应答研究[D];暨南大学;2012年
10 王沉;免疫应答对大鼠痛阈及电针镇痛的影响[D];辽宁中医学院;2001年
本文编号：
2879217
本文链接：https://www.wllwen.com/xiyixuelunwen/2879217.html
