CBT-Cys点击缩合反应与酶控自组装在免疫学中的应用

发布时间：2020-11-12 01:47

　　 通过半胱氨酸(Cys)上的1,2-氨基硫醇和氰基苯并噻唑(CBT)之间的点击缩合反应(CBT-Cys)或酶控自组装(EISA)等原理制备的超分子纳米材料己经成功地被用于分子影像(光学和磁共振等)、材料化学(制备纳米粒子和水凝胶等)以及对蛋白质的修饰等领域。虽然目前已经有不少研究者正致力于利用纳米材料对机体免疫系统进行调控进而对肿瘤或感染性疾病等免疫相关疾病进行干预,但通过使用CBT-Cys点击缩合反应或EISA原理设计的超分子纳米材料有目的地对免疫系统施加影响以干预疾病进程或者对这些材料可能在体内造成的与免疫系统相关的效应的研究则仍有待深入。基于肽链序列本身具备的天然属性所产生的高度生物兼容性,我们可以设计出多种功能小分子前体并通过CBT-Cys点击缩合反应或EISA原理使其以不同的途径或者在不同的部位发生自组装或解组装等过程以实现药物缓释或信号放大等目的。通过上述原理,我们在得到不同纳米结构(如纳米纤维或纳米粒子)的同时,也希望所设计的化合物能够在免疫相关疾病(如肿瘤、感染性疾病和自身免疫病等)的发生发展过程中实现增强药效、降低药物毒副作用或实时追踪相关生物学指标等目的。因此,基于目前依然存在于超分子化学和免疫学之间的大量研究空白,针对利用CBT-Cys点击缩合反应或EISA原理所制备的超分子纳米材料在免疫学中可能效应的深入研究具有广泛的应用前景和重要的科学价值。基于此,在本文中,我们合理地设计了不同的超分子化合物前体并通过以上两种超分子自组装原理实现了针对不同免疫学情境的功能应用:(1)高浓度紫杉醇(PTX)通常被用来作为一种化学疗法药物对抗肿瘤,但同时会对机体特别是免疫系统产生严重的毒副作用并反过来使得机体自身的免疫力被严重削弱。而当使用低浓度PTX时,研究发现该药物能够有效刺激免疫细胞的抗肿瘤潜能。因此,在高浓度下使用PTX并降低其对免疫系统的毒性而又能够保持其对免疫细胞的抗肿瘤潜力的刺激能力则仍然极具挑战性。本文中,我们合理地设计了一种 PTX 的衍生物(Cys(StBu)-Arg-Arg-Arg-Lys(PTX)-CBT(1))用以十分简便地制备包载PTX的纳米粒子(1-NP)。体外实验证实,在高PTX浓度下,1-NP较游离PTX表现出了更低的对于巨噬细胞的细胞毒性,同时其可以被巨噬细胞有效吞噬并随后以一种剂量依赖的方式使细胞极化为一种具备抗肿瘤活性的状态。体内实验进一步证明1-NP较游离PTX具有更强的抗肿瘤效应但同时其对存在于免疫器官以及肿瘤部位的免疫细胞的细胞毒性则明显更弱。我们的结果说明,通过使用不同剂量的1-NP,能够精确地对病人免疫系统的活化进行调控以获得更有效的抗肿瘤效果和可控的自身免疫应答。我们也需指出该治疗策略可作为一项结合免疫疗法和化学疗法二者优势的有效尝试并有望在将来达到更好的抗肿瘤临床疗效;(2)基质金属蛋白酶(MMPs)是在多种免疫相关疾病(如肝脏纤维化和肿瘤)中起到关键作用的一种蛋白酶家族。而截至目前,利用酶控近红外(NIR)荧光纳米粒子解组装促使荧光恢复对MMPs在疾病进程中的活性进行检测或成像的研究仍鲜有报道。本文中,我们合理地设计了一种新的荧光信号可以通过还原控制的缩合以及随后的纳米粒子(1-NP)自组装而发生自猝灭的NIR探针1。而通过基质金属蛋白酶2(MMP-2)的酶切,1-NP会被解组装而使NIR荧光得到恢复。利用这个过程,我们成功地在体外和活细胞中分别将1-NP运用于对MMP-2活性的NIR检测和成像。另外,我们也利用1-NP对裸鼠中的MC38结肠癌模型肿瘤中的MMP-2活性进行了特异性NIR成像。我们需要指出该NIR探针1可能在将来被进一步发展成在临床前研究甚至是临床研究中的肿瘤靶向成像工具;(3)地塞米松(Dex)是一种重要的抗炎药物但是高剂量使用Dex会引发严重的毒副作用。因此发明新的策略来促进Dex的抗炎效果便显得尤为重要但仍存在困难。本文中,我们利用一种酶控自组装系统发明了一种细胞内共组装的策略来增强Dex的抗炎能力。在碱性磷酸酶(ALP)的催化作用下,凝胶因子前体Nap-Phe-Phe-Tyr(H2PO3)-OH(1p)自组装成水凝胶Gel 1但地塞米松磷酸盐(Dp)则仅仅转变成Dex的沉淀。然而,将等量1p和Dp通过ALP诱导而发生共组装则形成了一种新的水凝胶Gel 2。两种炎症细胞模型实验说明细胞内的ALP诱发的Dp和1p的共组装极大地促进了 Dex的抗炎效力。我们指出我们的细胞内共组装策略或可以被广泛用于促进更多药物的治疗效果,而同时也可以被用来缓解这些药物的毒副作用;(4)肝脏纤维化可由多种慢性肝脏疾病引发,如果不对其进程进行及时有效干预,则会进一步发展为肝硬化甚至是肝细胞癌。抗炎疗法或可以作为一种标准的治疗肝脏纤维化的策略,但智能的、肝脏纤维化靶向的同时又能使抗炎药物(Dex)发生自组装和缓慢释放的抗肝纤维化疗法则仍然未见报道。本文中,我们合理地设计了一种凝胶因子前体Nap-Phe-Phe-Lys(Dex)-Tyr(H2PO3)-OH(1-Dex-P)并且提出了一种串联酶控自组装以及药物缓释策略使得Dex的抗肝脏纤维化效应较游离Dex在体外以及体内均明显提升。酶切实验证实1-Dex-P首先会被ALP脱磷酸化而转变成Nap-Phe-Phe-Lys(Dex)-Tyr-OH(1-Dex)并自组装成纳米纤维1-Dex,而该纳米纤维接着会被酯酶水解缓慢释放出Dex而转变成另一种纳米纤维1。我们设想该串联酶控策略可以在将来被广泛用于设计更多精致的药物输送体系从而增强药物的疗效。
【学位单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R392
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 CBT-Cys点击缩合反应简介
        1.1.1 CBT-Cys点击反应用于蛋白标记
        1.1.2 CBT-Cys点击反应用于分子影像
        1.1.3 CBT-Cys点击反应用于纳米结构自组装
        1.1.4 CBT-Cys点击反应用于癌症治疗
    1.2 超分子生物功能材料简介
    1.3 免疫系统和免疫学简介
    1.4 超分子自组装纳米材料在免疫学上的应用
    1.5 总结和展望
    1.6 论文的选题及主要工作
    参考文献
第二章 紫杉醇超分子自组装纳米粒子激活免疫系统抵抗癌症
    2.1 引言
    2.2 实验方法
        2.2.1 试剂及仪器型号
        2.2.2 小鼠
        2.2.3 骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）培养
        2.2.4 共孵育实验
        2.2.5 黑色素瘤肿瘤模型建立
        2.2.6 流式细胞术
        2.2.7 荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）
        2.2.8 细胞计数微球阵列实验（CBA）
        2.2.9 谷丙转氨酶（ALT）检测
        2.2.10 1以及1-NP的合成及表征
    2.3 结果
        2.3.1 化合物1的合成与表征以及1-NP的体外自组装
        2.3.2 高PTX浓度下1-NP对免疫细胞显示弱细胞毒性
        2.3.3 1-NP在体外能够刺激巨噬细胞表面过表达CD11b
        2.3.4 1-NP使巨噬细胞产生M1型极化而同时能够抑制其M2型极化
        2.3.5 1-NP以一种剂量依赖的方式刺激巨噬细胞极化
        2.3.6 1-NP较PTX具有更强的抗黑色素瘤效应,且该效应与其对免疫系统的刺激相关
        2.3.7 1-NP能够降低PTX在免疫器官和肿瘤部位对免疫细胞的细胞毒性,并且对治疗小鼠未表现出明显毒副作用
    2.4 讨论
    2.5 本章小结
    参考文献
第三章 自猝灭近红外荧光纳米粒子解组装实现基质金属蛋白酶有效检测
    3.1 引言
    3.2 实验方法
        3.2.1 实验材料
        3.2.2 主要的实验方法
        3.2.3 化合物的合成及表征
        3.2.4 MTT实验
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 设计思路
        3.3.2 利用1-NP对MMP-2活性进行体外NIR荧光检测
        3.3.3 在细胞中对MMP-2样活性进行NIR成像
        3.3.4 在荷瘤小鼠体内实现针对MMP-2酶样活性的NIR成像
    3.4 本章小结
    参考文献
第四章 细胞内共组装有效促进地塞米松的抗炎能力
    4.1 引言
    4.2 实验方法
        4.2.1 常规方法和材料
        4.2.2 水凝胶制备的常规程序
        4.2.3 骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）培养
        4.2.4 共孵育实验
        4.2.5 流式细胞术
        4.2.6 MTT实验
        4.2.7 化合物的合成及表征
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 1p和Dp能够通过酶控共组装形成新的水凝胶
        4.3.2 1p和Dp通过酶控共组装形成的水凝胶具有更强机械性能
        4.3.3 1p和Dp的酶控共组装能够明显提升Dex在细胞水平的抗炎能力
    4.4 小结与展望
    参考文献
第五章 串联酶控自组装和药物缓释增强地塞米松抗肝脏纤维化效应
    5.1 引言
    5.2 实验方法
        5.2.1 实验试剂和仪器
        5.2.2 水凝胶制备的常规方法
        5.2.3 骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）的培养
        5.2.4 细胞孵育实验
        5.2.5 流式细胞术
        5.2.6 MTT实验
        5.2.7 肝脏纤维化模型建立
        5.2.8 苏木精尹红（H&E）染色及天狼星红染色
        5.2.9 谷丙转氨酶（ALT）检测
        5.2.10 荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）
        5.2.11 数据分析
        5.2.12 化合物的合成及表征
    5.3 结果与讨论
        5.3.1 1-Dex-P能够在ALP和酯酶作用下发生串联自组装和药物缓释
        5.3.2 1-Dex-P的串联酶控自组装和药物缓释能够提升Dex抗细胞炎症的能力
        5.3.3 1-Dex-P的串联酶控自组装和药物缓释能够提升Dex的抗肝脏纤维化能力
    5.4 小结与展望
    参考文献
致谢
在读期间发表的学术论文与取得的研究成果

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 李湘洲;;自组装材料[J];金属世界;2006年01期

2 滇川;自组装材料[J];世界科学;1996年02期

3 李继东;蔡亚岐;史亚利;牟世芬;江桂斌;;离子型表面活性剂自组装体系在化学中的应用[J];化学进展;2007年10期

4 云中客;振荡引向自组装[J];物理;2003年05期

5 王韵晴;卢婷利;陈婷;马玉樊;赵雯;陈涛;;自组装多肽支架材料的研究进展[J];材料科学与工程学报;2012年02期

6 ;科学家发现DNA链自组装最佳长度[J];广西科学;2010年04期

7 杨传孝;黄承志;;毛细流自组装成环荧光显微测定血清样品中硫酸奎尼丁[J];分析化学;2006年02期

8 惠文杰,杨荣,张玉琦;自组装成膜技术及其研究进展[J];延安大学学报(自然科学版);2004年02期

9 李坚;姜德生;余海湖;;离子自组装镀膜机电路设计与软件开发[J];微计算机信息;2008年04期

10 郭彦;赵健伟;;自组装体系中分子间相互作用对其电化学行为的影响[J];化学通报;2007年12期

相关博士学位论文 前10条

1 唐维;CBT-Cys点击缩合反应与酶控自组装在免疫学中的应用[D];中国科学技术大学;2018年

2 何佩雷;双表面活性剂修饰多金属氧簇的自组装行为研究[D];清华大学;2016年

3 付华;有机磷辅助氨基酸自组装成肽及其机理研究[D];清华大学;1998年

4 解荡;含树枝状大分子体系的自组装及基于包结络合作用的超分子多嵌段聚合物研究[D];复旦大学;2007年

5 张振兴;功能化自组装多肽水凝胶与神经干细胞生物相容性研究[D];华中科技大学;2010年

6 薛斌;多肽自组装材料的物理力学性质及其应用[D];南京大学;2017年

7 陶凯;多肽自组装及其调控生长和诱导组装铂纳米晶体行为的研究[D];中国石油大学(华东);2013年

8 侯嘉骅;模板辅助多肽自组装的研究[D];内蒙古农业大学;2015年

9 闻瑾;金属表面和溶液中自组装体系的量子力学与分子力学研究[D];南京大学;2012年

10 刘正春;自组装化学镀及其应用研究[D];东南大学;2003年

相关硕士学位论文 前10条

1 马群;基于Fe_3O_4自组装探针的构建及其在硫化氢检测中的应用研究[D];上海师范大学;2018年

2 李娜;聚苯胺及苯胺低聚体的合成与自组装[D];中国科学技术大学;2017年

3 陈兴;溶剂和离子调控纳米ZnO自组装的研究[D];南京大学;2017年

4 徐腾焱;表面诱导自组装在荧光和肉眼检测血液中酶活性的运用[D];南开大学;2017年

5 孙力;两亲性嵌段共聚物的合成及其原位自组装的研究[D];华南理工大学;2016年

6 门永红;可控蒸发自组装及其高分子刷功能化的研究[D];宁波大学;2015年

7 齐宁宁;齐多夫定双头基两亲前药自组装体系的研究[D];沈阳药科大学;2007年

8 张少甫;基于自组装量子点的应力应变监测[D];华东理工大学;2017年

9 任庆娟;杯芳烃乙氧酰氯的双亲自组装及其反应[D];天津工业大学;2017年

10 刘芊;自组装功能膜的制备及应用[D];北京化工大学;2013年

本文编号：2880065