SIRT1的抑制剂EX527对耐药细胞侵袭转移的影响及机制研究

发布时间：2020-11-13 06:07

　　 背景食管癌已经成为全世界第八大恶性肿瘤和第六位癌症相关死亡的主要病因,大多数食管癌患者诊断时为晚期,肿瘤发生转移。长期或大剂量使用化疗药物易导致肿瘤耐药。Sirtuin1(SIRT1)属于哺乳动物sirtuin家族,由于在组蛋白和非组蛋白去乙酰化方面发挥重要作用,因此作为人类疾病的治疗靶标受到广泛关注,特别是对癌症方面的治疗。2005年,Elixir制药公司的科学家发现了第一种选择性吲哚结构的SIRT1抑制剂EX527,其IC50值为98 nM。目前为止,EX527仍是最有效的SIRT1选择性抑制剂。EX527与sirtuins结合发生在亚氨酸酯中间体形成和烟酰胺释放后,EX527抑制SIRT1活性的主要机制是阻断核糖-sirtuin复合物的形成。然而,SIRT1的抑制剂EX527是否对耐药肿瘤的转移侵袭有影响尚不清楚。该研究考察EX527对耐药食管癌细胞(EC109/PTX、TE-1/PTX)的迁移和侵袭能力的影响,并初步揭示SIRT1参与调控耐药食管癌细胞上皮-间质转化(EMT)的作用机制,为临床治疗食管癌耐药及转移提供理论依据。方法(1)MTT实验验证EC109/PTX和TE-1/PTX细胞对紫杉醇的敏感性;划痕和Transwell实验检测亲本及耐药细胞的迁移能力;Western blotting实验检测亲本细胞与耐药细胞中EMT相关蛋白表达;建立裸鼠皮下移植瘤模型,免疫组化实验检测EC109、EC109/PTX、TE-1、TE-1/PTX肿瘤组织中EMT相关蛋白的表达;Western blotting检测细胞耐药前后SIRT1、H4K16ac、P53ac的表达。(2)SIRT1抑制剂EX527对耐药食管癌细胞克隆形成的影响;Si RNA干扰SIRT1后H4K16ac、P53ac在耐药食管癌细胞中的表达;抑制剂EX527或Si RNA干扰SIRT1后,划痕和Transwell实验检测耐药细胞的迁移性。Western blotting及免疫荧光检测抑制SIRT1前后耐药细胞中EMT相关蛋白的表达;皮下接种移植瘤,腹腔注射EX527观察EX527对皮下移植瘤的抑制作用。结果(1)耐药食管癌细胞EC109/PTX、TE-1/PTX具有更强的迁移侵袭能力。通过MTT实验发现紫杉醇对EC109/PTX细胞的IC_(50)是对其亲本细胞的5.18倍;TE-1/PTX细胞的IC_(50)是对其亲本细胞的6.40倍。划痕和Transwell实验发现细胞耐药后其迁移能力明显比其相应的亲本细胞强。Western blotting实验及免疫荧光证实细胞耐药后EMT相关蛋白中N-cadherin、vimentin、snail的表达量明显升高。建立裸鼠皮下移植瘤模型,免疫组化检测肿瘤组织中EMT相关蛋白表达与体外实验结果一致,细胞耐药后N-cadherin、vimentin、snail的表达量升高。SIRT1在耐药食管癌细胞中表达量没有显著性差异,但细胞耐药后SIRT1下游蛋白H4K16ac、P53ac表达下降,说明SIRT1的去乙酰化活性增强。(2)抑制SIRT1的表达能抑制耐药食管癌细胞EMT转化。SIRT1的抑制剂EX527能抑制EC109/PTX和TE-1/PTX细胞集落形成。Si RNA或EX527干扰SIRT1后,划痕和Transwell实验发现耐药细胞侵袭迁移能力被抑制。抑制SIRT1后,Western blotting、免疫荧光和免疫组化发现N-cadherin、snail蛋白表达下调,而E-cadherin表达上调。皮下接种移植瘤,腹腔注射EX527(5 mg/kg)可抑制TE-1/PTX的裸鼠瘤体积。结论综上所述,通过从体内外两方面证明食管癌细胞(EC109、TE-1)耐药后,其侵袭迁移能力增强伴随着上皮-间质转化过程;抑制剂EX527抑制SIRT1可以显著降低耐药食管癌细胞的迁移和侵袭能力,进一步机制研究发现干扰SIRT1可以调控细胞上皮-间质转化(EMT)进程,改变细胞形态,调控耐药细胞的侵袭转移。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R965;R-332
【部分图文】：

（2）48 h 后收集细胞，1000 rpm 离心 4 min，弃去上清后加入 PBS 清洗细胞向每管细胞中加入 100 μL 左右的 RIPA 裂解液（含全蛋白酶抑制剂、磷酸酶制剂、PMSF）。（3）样品置于冰上裂解，每隔 10 min 吹打细胞一次，使细胞充分裂解。样品解 30 min 后放置低温高速离心机中离心（12000 rpm×10 min）。（4）将离心后的上清液吸至另一标记好的 1.5 mL 的离心管中，并记录液体的积。2.2.5.2 BCA 法测定蛋白浓度以及蛋白变性（1）BCA 工作液的配制：将工作液 A：B 以 50：1 的比例混合，室温放置待（2）绘制标准蛋白曲线：取不同体积终浓度为 0.5 mg/mL 的标准蛋白稀释使每个孔的蛋白浓度最终分别为 0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、6.00、8.00、1μg/μL，不足部分补加 PBS 构成 20 μL 体系，每个浓度设 3 个复孔。每孔加入μL 配好的 BCA 工作液，37 ℃恒温孵育 20 min。酶标仪在 562 nm 波长处检吸光度，根据吸光度值和蛋白浓度绘制标准曲线，得出标准方程。如图 2.1

该部分数据研究采用 SPSS13.0 软件分析。两组的组间分析采用 Students ttest。所有数值均采用均数±标准差（mean±SD），双侧检验 P 值＜0.05 认为有数据统计学差异。2.3 实验结果2.3.1 耐药细胞对紫杉醇的敏感性降低检测不同浓度的 PTX 对 EC109、EC109/PTX、TE-1、TE-1/PTX 细胞作用48 h 后细胞活力变化。在同一浓度的 PTX 作用下，耐药细胞组的细胞活力明显高于其亲本细胞组（图 2.1A，B）。实验数据表明，EC109 细胞的半数抑制率 IC50约为 371 nM，EC109/PTX 的 IC50约为 1926 nM，耐药细胞是亲本细胞的 5.19 倍；TE-1、TE-1/PTX 细胞的 IC50分别为 348 nM、2228 nM，耐药细胞 IC50是亲本细胞的 6.40 倍（表 2.1）。

食管癌细胞耐药后转移侵袭能力及 SIRT1 的表达2.3.2 细胞耐药后迁移能力增强通过细胞划痕实验测定 24 h 和 48 h 后 EC109、EC109/PTX、TE-1、TE-1/PTX细胞迁移能力的变化。结果表明耐药食管癌细胞株细胞迁移能力更强（图 2.2A）。测量划痕宽度的变化进行统计，48 h 后 EC109 细胞的划痕宽度是 EC109/PTX 细胞的 1.50 倍，这说明 EC109/PTX 细胞的迁移能力强于 EC109 细胞。TE-1 及TE-1/PTX 细胞在划痕 24 h 后实验结果具有显著性差异，TE-1 细胞的划痕宽度为（12.00±1.25），TE-1/PTX 细胞划痕宽度为（5.20±1.03），TE-1/PTX 细胞是TE-1 细胞的 2.30 倍（图 2.2 B）。
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本文编号：2881837