内质网应激在脂肪基质细胞诱导分化为星形胶质细胞过程中的作用

发布时间：2020-11-13 09:29

　　 目的分析脂肪基质细胞(Adipose-derived stromal cells,ADSC)诱导分化为星形胶质细胞过程中内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)的特征,从而明确ERS在这种诱导分化反应中的作用。方法1将ADSC从成人离体脂肪组织中提取后,进行传代与培养,选取生长状态良好的第3代ADSC,用DE-1诱导剂对其进行诱导分化,获得未诱导组及诱导48h、7d、14d、21d组细胞。倒置相差显微镜观察不同诱导时间组细胞的形态变化,并摄片存档。2免疫细胞化学技术检测ADSC未诱导组及各时间诱导组胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)、双链RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(PKR-like ER kinase,PERK)、活化转录因子6(Activating transcription factor6,ATF6)、葡萄糖调节蛋白(Glucose-regulated protein,GRP78/BiP)、和细胞凋亡蛋白增强子结合蛋白同源蛋白(Enhancer-binding protein-homologous proein,CHOP/GADDl53)、半胱天冬氨酸蛋白酶12(Cysteme aspartate specific protease 12,Caspase12)和半胱天冬氨酸蛋白酶3(Cysteme aspartate specific protease 3,Caspase3)的表达情况。3 Western-blotting法定量检测ADSC在未诱导组及各时间诱导组中GFAP、PERK、ATF6、GRP78、CHOP、Caspase12和Caspase3的表达水平。4免疫荧光化学法检测ADSC向星形胶质细胞诱导过程中GFAP与PERK、ATF6、GRP78、CHOP、Caspase12和Caspase3的共表达特征。5统计学分析:将全部实验数据应用Excel 2007建立数据库,应用SPSS17.0统计学软件对全部数据进行分析,计量资料以均数±标准差(sx±)表示,各组不同时间点间的比较采用单因素方差分析(one way ANOVA),各诱导水平之间的多重比较(两两比较)用LSD进行检验,以P0.05为差异具有统计学意义。结果1原代ADSC培养24h呈类圆形、锥形或短棒状,均匀贴壁生长;第3代第5天的ADSC呈长梭形,纤维细胞状,两端长突起纤细变长;ADSC诱导48h时形态不规则,两端长突起回缩,胞体伸出少量短小突起。诱导第7d时,胞体呈类圆形,突起变长,且数量增多,围绕胞体呈放射状生长。诱导14d时,胞体呈圆形或不规则形,胞体突起更加纤长,末端分叉生长。诱导21d时大部分ADSC凋亡,胞体的细胞膜破裂,突起回缩、断裂、数量减少。2免疫细胞化学法检测发现,ADSC未诱导组不表达GFAP,诱导48h、7d、14d、21d组均有阳性表达细胞,且其细胞阳性表达率在诱导14d明显高于其它各组(均P0.001),PERK、ATF6和GRP78在未诱导组和诱导各时间组均有阳性表达细胞,未诱导组细胞阳性表达率明显高于诱导各时间组,且随诱导时间延长而明显逐渐降低(均P0.001),CHOP、Caspase12和Caspase3在各组细胞组均可见阳性表达,而且其细胞阳性表达率随诱导时间的增长而逐渐增高,均在未诱导组最低,在诱导21d组最高(均P0.001)。3 Western-blotting法定量检测发现,未诱导组没有GFAP表达,诱导14d组表达水平明显高于48h、7d、21d组(均P0.001);各组均检测到PERK、ATF6、GRP78、CHOP、Caspase12和Caspase3的表达,PERK在未诱导组表达水平明显高于其它各组(P0.001),各组之间两两比较均有明显统计学差异(均P0.05),ATF6和GRP78的表达在未诱导组达峰值(均P0.001),诱导7d组与48h组无差异,其余各组间两两比较均有统计学差异(均P0.05),CHOP表达水平在诱导21d组明显高于其它各时间组(均P0.01),Caspase12表达水平在未诱导组与诱导48h组之间无差异,在诱导7d组与14d组之间也无差异性,但在其余各组之间的差异有统计学意义(均P0.05),Caspase3表达水平在诱导14d组与7d组无统计学差异,其余各组之间均有统计学差异性(均P0.05)。4免疫荧光化学法检测结果显示,在未诱导组无GFAP的绿色荧光阳性表达,但可见PERK、ATF6、GRP78、CHOP、Caspase12和Caspase3的红色荧光阳性表达。在诱导48h、7d、14d、21d组均可见GFAP/GRP78、GFAP/PERK、GFAP/ATF6、GFAP/CHOP、GFAP/Caspase12和GFAP/Caspase3的荧光共定位阳性表达。PERK、ATF6和GRP78的细胞阳性表达率随诱导反应时间延长而降低,未诱导组明显高于其它时间组(均P0.01),CHOP、Caspase12和Caspase3的细胞阳性表达率则随诱导时间延长而升高,在未诱导组最低,在诱导21d组最高(均P0.01)。结论在ADSC诱导分化为星形胶质细胞的过程中发生了内质网应激,且内质网应激引发的由ATF6和PERK信号通路介导的未折叠蛋白反应明显减弱,而内质网途径介导的细胞凋亡明显增强,特别是在诱导14d后急剧增加,是导致分化细胞死亡的主要原因。
【学位单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R329.2
【文章目录】：
摘要
abstract
英文缩略表
引言
第1章 实验研究
    1.1 材料与方法
        1.1.1 材料
        1.1.2 实验方法
    1.2 结果
        1.2.1 ADSC的培养和诱导为星形胶质细胞过程中的细胞形态学变化特征
        1.2.2 免疫细胞化学法检测ADSC向星形胶质细胞诱导过程中GFAP,PERK,ATF6,GRP78,CHOP,Caspase12和Caspase3的表达结果
        1.2.3 Western-blotting法检测ADSC向星形胶质细胞诱导过程中GFAP、PERK、ATF6、GRP78、CHOP、Caspase12和Caspase3的表达水平
        1.2.4 免疫荧光化学法检测ADSC向星形胶质细胞诱导过程中GFAP与PERK,ATF6,GRP78,CHOP,Caspase12和Caspase3共表达特征
    1.3 讨论
    1.4 结论
    参考文献
第2章 综述 ADSC源性星形胶质细胞内质网应激研究进展
    2.1 内质网应激反应
        2.1.1 内质网应激的起始-未折叠蛋白反应
        2.1.2 内质网应激的监测者-葡萄糖调节蛋白
    2.2 .内质网应激的促细胞存活通路
        2.2.1 PERK介导的生存信号PERK-eIF2α途径
        2.2.2 IRE1信号生存通路IRE1-XBP1途径
        2.2.3 ATF6途径
    2.3 .内质网应激的促细胞凋亡通路
        2.3.1 转录因子CHOP/GADD153的激活
        2.3.2 c-Jun氨基末端激酶的激活
        2.3.3 Caspase12蛋白酶途径的激活
        2.3.4 B淋巴细胞瘤-2家族成员和钙离子信号
    2.4 结语
    参考文献
结论
附录 图片
致谢
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【参考文献】

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本文编号：2882042