水凝胶基质力学环境下心肌干细胞分化研究

发布时间：2017-04-06 06:04

  本文关键词：水凝胶基质力学环境下心肌干细胞分化研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着我国人口老龄化步伐的加快，心肌梗死及缺血性心肌病等心脏类疾病的发病率及死亡率明显上升，严重威胁着人类健康。心肌干细胞（Cardiac Stem Cells,CSCs）由于具有自我复制、定向分化为心肌细胞的优势，且由于自体干细胞移植不会发生免疫排斥反应，亦不存在伦理问题，成为干细胞移植治疗心脏类疾病理想的种子细胞。处于心脏原位的CSCs数量极少，且更新率低，不足以完全修复心肌损伤与死亡，并且随着年龄增长，CSCs数量逐渐减少。因此进行干细胞移植治疗，首先需要解决的便是CSCs在体外的分离、纯化、扩增与定向分化问题。纯度高、活力强、数量足够、生物性能均一的CSCs才能满足组织工程及临床干细胞移植的需求。机体所有细胞均存在于力学微环境中，CSCs也不例外，因而探讨力学微环境对其增殖、分化与生长状态的影响，具现实意义。 本文旨在探究基底硬度对CSCs增殖、分化的影响。以不同浓度甲叉双丙烯酰胺为交联剂，聚合丙烯酰胺单体制作聚丙烯胺水凝胶（Polyacrylamide hydrogel, PAHG）。通过调节甲叉双丙烯酰胺的浓度，制备0.1%、0.3%、0.5%、0.6%4个梯度的PAHG，并结合培养细胞用的玻璃基底，作为CSCs粘附的基底。其中0.1%、0.3%的PAHG为硬度小于正常心肌组织模量的基底，0.5%、0.6%的PAHG为模拟正常心肌组织模量的基底，玻璃基底为硬度大于正常组织模量的基底。 通过EDU增殖试剂盒，测定基底硬度对CSCs增殖的影响；通过分化后的细胞形态，以及对分化后细胞表面表达的特异蛋白进行细胞免疫荧光分析，评定基底硬度对CSCs分化的影响。结果表明：在0.5%、0.6%的PAHG基底上，模量为15kPa左右，接近心脏生理模量18±2kPa，CSCs增殖率较高且维持较高的分化潜能；在0.1%、0.3%的PAHG基底上，模量为2~7kPa，远低于心脏生理模量，，CSCs的增殖、分化均几乎处于停滞状态；玻璃基底模量为Gpa级别，远远高于心脏生理模量，CSCs的增殖加快并启动分化机制。 研究基底硬度对CSCs增殖、分化的影响，为认识保持干细胞干性的细胞培养条件和环境，进而体外对分离、纯化的CSCs进行扩增，从而为满足干细胞临床移植的需求提供实验依据。 本文主要分七章进行论述，第一章是绪论，综述CSCs各亚型研究情况，以及基底硬度对干细胞影响的相关研究进展；第二、三章是实验材料——CSCs的分离及纯化获取，纯度高、活性强的CSCs是决定后续实验研究成败的关键；第四章为实验研究所用的基底——PAHG的制备，凝胶制备完成后，表面的处理是关键，决定着细胞能否良好地贴附生长；第五章探讨基底硬度对CSCs增殖的影响，主要利用EDU增殖试剂盒来测定；第六章探讨基底硬度对CSCs分化的影响，主要通过观察分化后的细胞形态，以及对心肌向分化特异蛋白进行细胞免疫染色来进行评定；第七章为全文总结及后继工作展望。
【关键词】：水凝胶基底 心肌干细胞 力学环境 增殖 分化
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 第一章 绪论10-15
• 1.1 CSCs 的来源与亚型10-12
• 1.1.1 CSCs 的来源10
• 1.1.2 CSCs 亚型组成10-11
• 1.1.3 CSCs 获取方法11-12
• 1.2 基底硬度对干细胞的影响12-13
• 1.2.1 基底硬度对胚胎干细胞（ESCs）的影响12
• 1.2.2 基底硬度对间充质干细胞（MSCs）的影响12-13
• 1.2.3 基底硬度对其他干细胞的影响13
• 1.2.4 小结13
• 1.3 本文主要工作13-15
• 第二章 CSCs 的原代培养15-21
• 2.1 引言15
• 2.2 实验材料15-16
• 2.2.1 实验动物15
• 2.2.2 实验试剂15-16
• 2.2.3 实验仪器、器材16
• 2.3 实验方法16-17
• 2.3.1 实验器材处理16
• 2.3.2 主要实验试剂的配制16-17
• 2.3.3 组织块培养法17
• 2.4 实验结果17-19
• 2.5 小结与讨论19-21
• 第三章 CSCs 的纯化及鉴定分析21-33
• 3.1 引言21-22
• 3.2 实验材料22-23
• 3.2.1 实验试剂22-23
• 3.2.2 实验仪器、器材23
• 3.3 实验方法23-27
• 3.3.1 器材处理方法23
• 3.3.2 主要实验试剂的配制23-24
• 3.3.3 CSCs 的纯化24-25
• 3.3.4 CSCs 的鉴定分析25-27
• 3.4 实验结果27-30
• 3.4.1 细胞纯化结果27
• 3.4.2 CSCs 细胞表面抗原鉴定结果27-30
• 3.5 小结与讨论30-33
• 第四章 聚丙烯酰胺水凝胶（PAHG）基底的制备33-40
• 4.1 引言33-34
• 4.2 实验材料34-35
• 4.2.1 实验试剂34
• 4.2.2 实验仪器、器材34-35
• 4.3 实验方法35-38
• 4.3.1 实验器材处理35
• 4.3.2 主要实验试剂的配制35
• 4.3.3 聚丙烯酰胺凝胶制备35-37
• 4.3.4 凝胶表面胶原铺被37
• 4.3.5 细胞接种培养37-38
• 4.4 实验结果38-39
• 4.4.1 水凝胶制备38
• 4.4.2 凝胶上细胞接种培养38-39
• 4.5 小结与讨论39-40
• 第五章 水凝胶基质力学环境下 CSCs 增殖分析40-50
• 5.1 引言40-41
• 5.2 实验材料41
• 5.2.1 实验试剂41
• 5.2.2 实验仪器、器材41
• 5.3 实验方法41-43
• 5.3.1 主要实验试剂的配制41
• 5.3.2 EdU 增殖试剂盒检测 CSCs 增殖率41-43
• 5.4 实验结果43-48
• 5.4.1 不同硬度基底上 CSCs EDU 增殖检测结果43-45
• 5.4.2 不同硬度基底上 CSCs 增殖率比较分析45-48
• 5.5 小结与讨论48-50
• 第六章 水凝胶基底力学环境下 CSCs 分化分析50-61
• 6.1 引言50
• 6.2 实验材料50-51
• 6.2.1 实验试剂50-51
• 6.2.2 实验仪器、器材51
• 6.3 实验方法51-54
• 6.3.1 主要实验试剂的配制51-52
• 6.3.2 细胞免疫荧光法检测α-actinin 的表达52
• 6.3.3 细胞免疫荧光法检测 cTnT 的表达52-53
• 6.3.4 细胞免疫荧光法检测α-SMA 的表达53-54
• 6.4 实验结果54-60
• 6.4.1 梯度 PAHG 上接种的 CSCs 分化后形态对比54-57
• 6.4.2 梯度胶上 CSCs 分化细胞免疫染色结果57-60
• 6.5 小结与讨论60-61
• 第七章 总结与展望61-63
• 参考文献63-69
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文69-70
• 致谢70

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

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本文编号：288360