肺炎链球菌PepO依赖miR-155和TLR2增强巨噬细胞的吞噬能力

发布时间：2020-11-16 11:55

　　 背景了解细菌蛋白对免疫细胞的作用效应是评价其是否能用于抵抗细菌感染的重要依据。PepO是一种细菌中保守存在的肽链内切酶类蛋白,其缺陷菌株粘附和侵袭能力较野生菌株明显减弱,是肺炎链球菌中一个新毒力因子。我们的研究显示PepO有强烈的肺部致炎作用,但其导致的免疫效应和具体机制尚不清楚。肺泡巨噬细胞在宿主防御呼吸道细菌感染中发挥着重要作用,肺部对肺炎链球菌的清除始于巨噬细胞,因此本研究拟以巨噬细胞为研究对象,探究PepO对巨噬细胞的作用效应及相关机制。方法经典吞噬实验观察PepO刺激腹腔来源的巨噬细胞后其吞噬能力的改变;Q-PCR检测PepO诱导巨噬细胞的miR-155、SHIP1 mRNA的表达变化;Western blot检测PepO诱导巨噬细胞的SHIP1、AKT、NF-k B蛋白表达变化;转染miR-155的mimic或inhibitor,以过表达或降低该基因的胞内水平,检测巨噬细胞的吞噬能力改变和SHIP1mRNA表达水平的变化;采用信号通路抑制剂联合PepO处理巨噬细胞,Q-PCR检测miR-155的表达;采用荧光素酶报告基因检测miR-155靶向SHIP1的荧光素酶活性;采用免疫荧光检测巨噬细胞对细菌的吞噬能力改变,表面受体CR3表达情况,及NF-kB核转位的变化。结果PepO处理巨噬细胞后,细胞对肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌的吞噬能力增强,呈剂量和时间依赖性。Q-PCR结果显示,PepO刺激巨噬细胞后,其miRNA-155的表达较对照组显著升高,呈剂量和时间依赖性。转染miRNA-155抑制剂的巨噬细胞,PepO处理后其吞噬细菌的能力较转染阴性对照的巨噬细胞显著下调,而转染miRNA-155的mimic巨噬细胞的吞噬细菌能力较相应对照细胞显著上升,提示PepO可通过诱导miRNA-155的表达促进巨噬细胞的吞噬能力。荧光素酶报告SHIP1基因检测结果显示,转染miRNA-155的细胞其荧光素酶活性较对照细胞显著升高,证明miRNA-155的确能靶向调控SHIP1基因表达。Q-PCR和Western bloting结果显示,PepO诱导的巨噬细胞较对照细胞的SHIP1表达显著下调,且呈剂量和时间依赖性。而转染miRNA-155抑制剂的巨噬细胞,PepO处理后其SHIP1的mRNA表达水平较转染阴性对照的巨噬细胞显著下调,转染miRNA-155 mimic的巨噬细胞,PepO处理后其SHIP1的mRNA表达水平较转染阴性对照的巨噬细胞显著上调,这些结果提示PepO可通过miRNA-155调控SHIP1的表达。CR3为巨噬细胞识别细菌的受体之一,有文献提示其表达受SHIP1的负调控,我们的免疫荧光检测结果显示,PepO处理巨噬细胞后其CR3较阴性对照组显著升高。这些结果提示PepO可能通过诱导miRNA-155下调SHIP1表达,从而促进CR3表达增加而提高巨噬细胞的吞噬能力。将PepO分别处理TLR2缺陷小鼠来源的腹腔巨噬细胞和野生鼠的巨噬细胞,结果显示TLR2缺陷鼠的巨噬细胞表达miRNA-155较野生鼠显著降低,其SHIP1的表达水平不随PepO刺激的时间延长而降低,同时其CR3的表达水平也不像野生鼠的巨噬细胞,因PepO的刺激而显著增高。抑制剂实验结果显示,Akt和NF-κB的抑制剂处理细胞后,PepO刺激的miRNA-155表达较未处理组显著下调。PepO刺激后巨噬细胞的Akt磷酸化水平显著增高,NF-κB的含量及入核量显著增加,而TLR2缺陷鼠的巨噬细胞在受到PepO刺激后,仍存在Akt磷酸化水平增高,但NF-κB的含量及入核量无显著改变,这些结果提示PepO主要依赖于TLR2-NF-κB通路诱导miRNA-155的表达上调。结论PepO可通过TLR2-NF-κB信号通路诱导miRNA-155表达增高,增强巨噬细胞的吞噬能力,该作用还可能与SHIP1表达的下调以及CR3表达上调相关。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：R378.1
【文章目录】：
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前言
1 实验材料
2 实验方法
3 实验结果
4 讨论
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本文编号：2886199