豚鼠诱导性多能干细胞样细胞的建立

发布时间：2017-04-06 12:02

  本文关键词：豚鼠诱导性多能干细胞样细胞的建立，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)是指将体细胞进行重编程,转化为具有胚胎干细胞特性和功能的多能干细胞。诱导多能干细胞可以自我更新并可分化成各种类型的体细胞,不仅在替代疗法上有重要价值,还可用于体外疾病模型的建立,以方便疾病机制的研究、药物的监测以及新治疗方法的检验。豚鼠(guinea pigs)由于具有某些特殊的生理解剖特点和生物学特性而被广泛应用于生物医学的各个领域,故可以作为研究许多疾病致病机理与药物筛选的理想动物模型。但迄今为止,尚没有有关豚鼠iPS细胞的研究报道。本研究以慢病毒为载体,以传统的四因子诱导法(oct4、sox2、klf4和c-myc)对分离的胎儿豚鼠成纤维细胞进行重编程,以获得重编程的豚鼠iPS细胞系,为后续建立动物疾病模型和药物筛选模型奠定基础。实验结果如下：1.通过组织块贴壁法分别分离得到小鼠胚胎成纤维细胞和豚鼠胎儿成纤维细胞,两种细胞均可稳定传代。豚鼠胎儿成纤维细胞在病毒感染和多次传代后,细胞周期依旧正常,说明其可以作为重编程的靶细胞。2.使用四种不同转染试剂：磷酸钙法、脂质体2000、脂质体LTX和QuickShuttle-293试剂,通过三质粒共转染293T细胞,比较以上四种试剂对编码绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组慢病毒载体的包装效率和对包装细胞的毒性作用,以及包装获得的病毒感染豚鼠胎儿成纤维细胞的能力。通过流式细胞技术和MTT法分别检测阳性细胞数和细胞活性,最终显示了QuickShuttle-293转染试剂无论在慢病毒包装过程中的转染效率、细胞毒性及包装后病毒的感染效率方面显示出较好的效果。3.通过编码传统四因子(oct4、sox2、klf4和c-myc)基因的重组慢病毒感染豚鼠胎儿成纤维细胞,使之成功重编程为豚鼠iPS细胞,并比较了3种小分子物质(维生素C、丙戊酸钠、丁酸钠)对细胞重编程的促进作用,最终发现添加维生素C和丙戊酸钠的培养基对重编程效率有着明显提升。对所得到的豚鼠iPS样克隆进行了生物学特性检测：1)对豚鼠iPS样细胞进行碱性磷酸酶染色,结果呈阳性；2)提取豚鼠iPS样细胞RNA, RT-PCR检测ES细胞相关标记基因,结果显示其内源性表达oct4, sox2, klf4, c-myc以及nanog基因；qPCR结果显示,内源性oct4、sox2、klf4、c-myc和nanog基因的表达远高于对照豚鼠成纤维细胞；3)提取豚鼠iPS样细胞总蛋白,western blot结果显示其高表达两种ES细胞标记蛋白：oct4和nanogo表明得到的豚鼠iPS细胞是具有多能性的。
【关键词】：诱导性多能干细胞 转录因子 慢病毒 豚鼠成纤维细胞 细胞重编程
【学位授予单位】：宁夏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 英文缩略词表7-9
• 第一章 文献综述9-19
• 1.1 体细胞重编程的机制和方法9-11
• 1.2 多能性干细胞的诱导方法和机制11-14
• 1.3 诱导性多能干细胞的研究现状和应用前景14-17
• 1.4 iPS细胞存在的问题17-18
• 1.5 本研究的目的和意义18-19
• 第二章 豚鼠胎儿成纤维细胞的分离培养及生物学特性分析19-28
• 引言19
• 2.1 试验材料及试剂19-20
• 2.2 试验方法20-23
• 2.3 结果与分析23-26
• 2.4 讨论26-27
• 2.5 小结27-28
• 第三章 不同转染试剂对慢病毒包装及包装后病毒感染豚鼠成纤维细胞效率的影响28-38
• 引言28
• 3.1 实验材料28-29
• 3.2 实验方法29-32
• 3.3 实验结果32-36
• 3.4 讨论36-37
• 3.5 小结37-38
• 第四章 豚鼠胎儿成纤维细胞来源的iPS细胞诱导及鉴定38-52
• 引言38
• 4.1 实验材料38-39
• 4.2 实验方法39-46
• 4.3 实验结果46-50
• 4.4 讨论50-51
• 4.5 小结51-52
• 结论52-53
• 参考文献53-63
• 致谢63-64
• 个人简介64

【引证文献】

中国重要会议论文全文数据库 前1条

1 刘璐璐;刘启兵;许雪娇;黄继云;颜森泉;韩峰;楼宜嘉;;阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导基因转染对内皮细胞株的毒性作用[A];中国毒理学会第五次全国学术大会论文集[C];2009年

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本文编号：288808