蠕形螨对共培养HaCaT细胞的TLR2以及炎症相关基因表达的影响

发布时间：2020-11-18 16:59

　　 目的通过建立毛囊蠕形螨与HaCaT细胞共培养体系,探讨毛囊蠕形螨与细胞表达TLR2以及炎症相关基因之间的关联性。方法用10只、30只、50只毛囊蠕形螨和空白对照分别与HaCaT细胞共培养24 h,提取细胞RNA,反转录成cDNA;设计特异性引物,对TLR2以及相关的KLK5、IL-1β、IL-6、IL-8和CCL2等炎性因子进行常规PCR扩增、克隆和测序;采用qRT-PCR检测表达量,比较与螨虫数之间的关联性。结果琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物为单一清晰条带,序列大小与模板一致,表明引物特异性好。qRT-PCR检测显示,除10只螨虫组与空白组差异均无统计学意义外(t=0. 00～2. 25,P0. 05),TLR2和IL-6在30只和50只螨虫组与空白组差异有统计学意义(TLR2:t=6. 54和10. 85; IL-6:t=14. 35和17. 52,P0. 001),且50只螨虫组上调明显大于30只螨虫组; IL-8、CCL2和KLK5在30只和50只螨虫组与空白组的差异也有统计学意义(IL-8:t=5. 34和6. 98; CCL2:t=3. 12和4. 03; KLK5:t=3. 31和4. 05,P0. 05),但30只与50只螨虫组的差异无统计学意义;而IL-1β只在50只螨虫组与空白组的差异有统计学意义(t=2. 60,P0. 05),30只螨虫组与空白组的差异无统计学意义。HaCaT细胞TLR2的表达与蠕形螨虫数呈正相关(r=0. 984),与TLR2调控的炎性因子IL-6、IL-8、CCL2、KLK5和IL-1β的表达也呈正相关(r=0. 970、0. 984、0. 985、0. 974和0. 938),尤其是TLR2和IL-6表达量变化最明显。结论本研究成功构建了毛囊蠕形螨与HaCaT细胞共培养体系,首次从细胞水平揭示皮肤免疫反应与蠕形螨感染数量有关,这一探索性研究结果对于揭示蠕形螨寄生诱发面部皮肤损害的分子机制具有重要的科学意义。
【部分图文】：

图4显示，目的基因qRT-PCR扩增曲线平整呈“S型”，复孔重复性好，阴性对照无扩增，表明加样准确且无污染;熔解曲线显示各基因解链温度在83～89℃之间，均为单峰，不存在引物二聚体或非特异性扩增，说明产物特异性好，定量结果准确。图2 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

图1 共培养前的Ha Ca T细胞形态(A)与共培养24 h后的螨虫形态(B)qRT-PCR结果显示(图5、图6和表2)，虽然六个目的基因的相对mRNA表达量在10只螨虫组与空白组差异无统计学意义，但TLR2和KLK5表达量与虫数呈正相关，相关性有统计学意义(r=0.984和0.974,P<0.05)。30只螨虫组TLR2表达量明显高于10只螨虫组和空白组(t=6.35和6.54,P<0.001);50只螨虫组高于30只螨虫组(t=4.31,P=0.003)。30只螨虫组KLK5只高于空白组(t=3.31,P=0.011)，不高于10只组;但50只螨虫组高于10只螨虫组(t=2.79,P=0.024)。

炎症相关因子IL-6、IL-8和CCL2表达量与虫数也呈明显正相关(r=0.970、0.984和0.985,P<0.05),IL-1β相关性不显著(r=0.938,P>0.05)。在IL-6，表达量随虫数变化上调最明显，50只螨虫组、30只螨虫组和10只螨虫组两两之间的差异均有统计学意义。在IL-8,50只螨虫组和30只螨虫组均明显高于10只螨虫组和空白组，但50只组和30只组之间的差异无统计学意义(t=1.64,P=0.139)。在CCL2,50只螨虫组与10只螨虫组和空白组的差异有统计学意义(t=3.09,P=0.015;t=4.03,P=0.04),30只螨虫组与空白组差异也有统计学意义(t=3.12,P=0.014)，但其他各组两两比较差异无统计学意义。在IL-1β，随虫数增加表达量变化更小，只有50只螨虫组与空白组差异有统计学意义(t=2.60,P=0.032)。图4 qRT-PCR扩增曲线(A-C,G-I)和熔解曲线(D-F,J-L)
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