联体共生小鼠模型中肝细胞衰老逆转的研究

发布时间：2020-11-20 18:40

　　 细胞衰老是指在DNA损伤、端粒酶活性丢失等内在因素和细胞间通讯改变、体液循环因子改变等外在条件的刺激下,细胞发生一系列形态结构的改变,导致细胞永久性退出分裂周期,无法发挥正常生理功能。而衰老细胞的累积会导致组织器官的衰老,进而引发组织器官衰老问题,如机体的结构和功能异常和各种衰老相关疾病的发生。肝脏是一个以代谢为核心功能的器官,而肝细胞是肝脏组织中最主要的实质细胞。胆汁合成、肝糖贮存、脂质代谢等多种肝功能都是由肝细胞来承担的。随着年龄增长,老年肝脏肝细胞的形态、结构和功能发生了一系变化,比如肝细胞体积变大,数量减少、增殖能力降低、肝细胞核出现空泡,胞质出现脂褐素沉积、DNA含量异常,巨核肝细胞比例升高等。然而,由于衰老肝细胞的结构改变和功能异常,导致老年个体更容易发生各种肝脏疾病。比如老年个体容易出现肝脏脂肪性病变,老年小鼠中应对CCl_4等化学药物的能力下降,肝脏的炎症水平升高,加速肝脏纤维化病症的发生发展。由此可见,肝细胞衰老与肝脏疾病发生发展紧密相关。因此,探寻肝细胞衰老逆转的途径是老年肝脏疾病治疗的必然要求。然而由于肝脏衰老模型小鼠缺乏等各种困难,目前仍无法获得肝细胞衰老逆转的深入研究。本项目研究中,基于联体共生模型,使得联体的两只小鼠可以共享彼此的血液微环境途径而用来探讨微环境对肝细胞衰老逆转的作用。首先,我们分别建立了2月龄和24月龄小鼠间联体(联体的2月龄为Het-Y,联体的24月龄小鼠为Het-O)、相同月龄的年轻小鼠间联体(联体的同月龄小鼠都称为Iso-Y)和相同月龄的老年小鼠间联体(联体的老年小鼠都称为Iso-O)3种联体共生模型。通过流式分析结果显示联体小鼠间血液交换率接近50%。成功构建联体共生模型后,使得联体小鼠共同生活5周,然后分别对不同组联体小鼠肝脏肝细胞进行生物学特征和肝细胞功能的分析,评价年轻微环境对衰老肝细胞逆转的作用。细胞衰老相关指标的检测结果显示,在年轻血液微环境的作用下,与Iso-O小鼠相比,老年小鼠SA-β-gal阳性率从38.23%±1.86%降低到4.84%±0.71%;γ-H2A.X阳性率从53.98%±3.78%降低到15.46%±1.86%;衰老指标细胞周期抑制因子P53、P21和P16的表达明显降低(p0.01);炎症因子IL-1β、IL-6和IL-8的表达水平也降低(p0.01)。其次,老年小鼠肝脏多倍体肝细胞数量增加,而多倍体肝细胞发生衰老的可能性增加。通过肝细胞比例分析发现,在年轻微环境的作用下,与Iso-O相比,老年小鼠八倍体肝细胞比例从33.35%±0.85%降低到15.97%±0.84%;二倍体肝细胞比例从7.41%±0.54%升高到27.27%±0.71%。进一步对肝细胞数目和大小进行分析,结果显示,在年轻微环境作用下,相同视野范围内,老年肝脏肝细胞数目从402±18个增加到617±42个,细胞面积也从645.99±32.72μm~2减小至356.93±22.33μm~2。前期的研究表明随着年龄的增加肝细胞增殖能力降低,体现在小鼠肝脏肝切后肝脏再生能力减弱和衰老肝细胞移植后再殖能力的下降。然而老年小鼠在年轻小鼠血液的影响下,其增殖能力发生了明显变化。原位肝组织增殖能力检测和原代肝细胞体外短期培养结果都显示,年轻微环境作用下,衰老肝细胞增殖能力得到恢复,增殖水平与年轻小鼠相类似。上述结果证实:在年轻微环境作用下,衰老肝细胞的衰老指标消失了,衰老肝细胞的形态、结构发生了衰老逆转,且重新获得了类似年轻肝细胞的增殖潜能。.衰老肝细胞发生系列形态结构和功能的改变,导致其对外界刺激的耐受力下降,因而慢性肝炎、肝纤维化、肝癌等肝脏疾病在老年个体中发生机会增加。随着年龄的增长,衰老肝细胞出现脂质代谢障碍,肝脏内脂肪累积的水平提高,老年肝脏脂肪病变的发生几率明显增加。在联体共生模型中,我们发现老年小鼠在年轻血液微环境的调控下,老年肝脏脂肪累积程度得到明显的缓解。肝脏脂滴原位染色结果显示,年轻微环境的作用下,于Iso-O相比较,油红O的阳性面积从24.01%±3.48%降低到4.15%±2.95%,且尼罗红的阳性面积也降低4倍。血清学指标也显示老年小鼠TG、胆固醇和LDL-c水平明显降低(p0.01),且肝损伤指标ALT和AST的表达水平也降低(p0.01)。综合上述实验结果,我们可以得出结论:在年轻血液微环境的作用下,老年衰老肝细胞的衰老表型发生逆转,多倍体肝细胞比例降低,增殖能力得到提高。而且年轻血液微环境促进了衰老肝细胞脂肪累积水平的降低,不仅提高了肝细胞的脂质代谢能力,也改善了衰老肝脏的肝功能水平。这一重要发现,为解决衰老肝细胞增殖缓慢和老年个体肝衰竭相关疾病高频病发而难治愈问题提供新的思路,也为理解衰老和微环境的关系、衰老肝细胞发生“返老还童”机制和延缓或有效控制肝细胞衰老提供了理论基础。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R-332;R575
【部分图文】：

从而实现细胞的衰老逆转已经分别在大脑、骨骼肌、心脏、肾脏、胰腺等器官中得到运用（图1）。（二）联体共生模型下细胞衰老逆转的研究进展脱髓鞘是一种老年神经系统疾病，发病原因在于老年少突胶质前体细胞（OPC）

-图 2 联体共生小鼠模型的构建：联体小鼠模型构建及分析的技术路线；B、C：联体 2 周时，两只小鼠协调配合，共同；D：三种联体模型小鼠体重的变化情况。Iso-Y 表示 2 月龄小鼠和 2 月龄小鼠联体组合so-O 表示 24 月龄小鼠和 24 月龄小鼠联体组合，Het 表示 2 月龄小鼠和 24 月龄小鼠联体。

士学位论文联体共生模型成功建立的评价体系联体模型的有效性，我们将野生型 2 月龄 C57BL/6 小鼠与表达 GFP 的 2 月龄转基因小鼠进行联体。取联体 5 周后的行流式分析。结果如图 3 所示，联体前，野生型小鼠中不细胞，而转基因小鼠 99%以上细胞都带有绿色荧光标记。带绿色荧光的细胞进入野生型小鼠体内，野生型小鼠中的了转基因小鼠体内，说明联体两只小鼠之间可以建立毛细体 5 周时，联体小鼠间完成血液交换，血细胞交换率接近体模型可以用来研究年轻微环境对老年小鼠的影响。
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本文编号：2891824