五种Ⅰ型登革病毒的毒力差异及内在分子机制的研究

发布时间：2020-11-20 22:33

　　 登革病毒(Dengue virus,DENV)是目前最流行的蚊媒病毒之一,其广泛流行于热带、亚热带地区。DENV引起的一系列的症状如登革出血热/登革休克综合征(Dengue hemorrhagic fever/Dengue shock syndrome,DSS/DHF)已经严重威胁人类的健康。DENV作为黄病毒科黄病毒属的单股正链RNA病毒,缺乏精确的复制校正系统,在长期传播过程中病毒的核苷酸会发生变化最终导致病毒毒力变强亦或是变弱;其次,病毒侵染机体会导致相应的宿主反应,二者相互作用的结果影响着病毒的长期毒力。所以这两方面的因素对DENV感染后是否致病以及疾病的严重程度起着至关重要的作用。因此,进一步找寻DENV毒力相关位点以及研究病毒与宿主的相互作用具有重要意义。在过去的25年,中国广东省每年都有报告登革热病例,在2014年出现了历史高峰,当年的病毒主要以血清型1的DENV(DENV1)为主。我们实验室获取了 2014年广东省登革热爆发期间从急性期病人血清中分离得到的DENV-1型5种变异株,分别命名为 DENV1A、DENV1B、DENV1C、DENV1D、DENV1E。为了研究不同基因型的DENV-1的复制及毒力差异,我们首先用这5种变异株分别感染人胚肾细胞(293T)和蚊虫细胞(C6/36),观察病毒体外复制能力的强弱;其次,通过病毒感染乳鼠实验,分析5种变异株的体内毒力差异。体内体外结果显示,5种变异株中的DENV1B在哺乳动物细胞及蚊虫细胞中的复制能力以及对乳鼠神经毒力都较其他变异株强。相反,DENV1E则最弱。为了进一步了解5种变异株毒力强弱的分子机制,我们分别从变异株逃逸宿主天然免疫的能力以及毒株自身蛋白结构及功能两个方面来研究。(1)5种变异株逃逸宿主天然免疫的能力:DENV感染宿主时,天然免疫系统作为抵御病毒入侵的第一道防线,会立即被激活。我们重点关注干扰素介导的天然免疫应答机制,主要研究5种变异株的非结构蛋白抑制干扰素(Interferon,IFN)产生的差异。我们分别构建了5种变异株的非结构蛋白的真核表达质粒,进行双荧光素酶报告基因检测,结果显示,DENV1B的非结构蛋白(NS2A、NS2B、NS4A)抑制RIG-I介导的IFN-β的产生较DENV1E强。与此同时,我们通过定点突变登革病毒DNA型复制子(DGL2)NS2A第66位的氨基酸,发现该位点突变后,病毒复制子的复制能力显著变弱。但是,我们用病毒感染IFNAR-/-(I型干扰素受体缺陷)小鼠及其原代细胞意外地发现,在干扰素介导的天然免疫应答存在缺陷的情况下,DENV1B的病毒载量还是比DENV1E的高。于是,我们推测2种变异株逃逸宿主抗病毒免疫反应的差异并不是导致DENV1B比DENV1E毒力强的唯一因素。病毒某些位点的氨基酸发生突变致使自身蛋白结构及功能发生改变,也可能导致病毒株的复制能力及毒力变强或是变弱。(2)5种变异株自身结构的差异:①通过高通量测序技术获取了 5种变异株的全基因组序列,系统进化分析:DENV1A/2014、DENV1B/2014和DENV1C/2014同属于DENV-1型基因1型,DENV1D/2014和DENV1E/2014属于DENV-1型基因V型。亲缘关系上DENV1B与DENV1C接近,它们与DENV1D和DENV1E进化距离最远;②3'UTR比对分析和二级结构预测结果显示:DENV1DE的3'UTR区存在缺失,二级结构也不如DENV1ABC的稳定;③DENV的NS3作为一种丝氨酸蛋白酶,对病毒蛋白的成熟起着至关重要的作用。NS2B作为辅因子激活酶在NS3丝氨酸蛋白酶的活化中起着关键作用。我们采用原核蛋白表达纯化的方法,获得了具有蛋白酶活性的DENV1B-NS2B3和DENV1E-NS2B3重组蛋白,通过酶活实验发现DENV1B-NS2B3对底物的切割效率较高。序列比对结果显示,两种病毒的辅酶结构域NS2B(H)的第55位的氨基酸有差异。我们将DENV1B-NS2B3蛋白中55位的赖氨酸(Lysine,K)突变为精氨酸(Arginine,R),NS2B(H)-NS3蛋白酶切割底物的效率有所下降。我们进一步通过定点突变DGL2 NS2B第55位的氨基酸,发现该位点突变后显著地削弱了病毒的复制能力。综上所述,本研究主要比较了5种变异株的复制能力及毒力差异,发现了DENV1B的复制能力及毒力最强的,而DENV1E最弱。探索内在分子机制的过程中,我们发现了 NS2A第66位氨基酸及NS2B第55位的氨基酸是病毒潜在的毒力决定位点,为更好地理解DENV毒力强弱的分子机制提供了理论依据,也为研究DENV蛋白功能,致病机制及新型减毒疫苗提供新思路。
【学位单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R373
【部分图文】：

问题之一?［２］。??我国南方毗邻东南亚登革热疫区国家，白纹伊蚊分布广泛，是登革热疫情的??高危爆发流行地区［３］（图１绿色箭头标注）。上世纪２０－４０年代，我国南方曾有过??登革热流行，随后销声匿迹数十年。直至１９７８年，广东省佛山市发生登革热爆发??流行，此后，我国南方地区登革热疫情连年不断，登革热被认为由输入病例引起??的本地爆发疫情［４，?５］，尤其是广东地区。广州市是中国南方最大的大都市，人口??超过１３００万，且广州属亚热带季风气候，夏季炎热潮湿，冬季温和干燥，使得白??纹伊蚊在冬季依然能够生存，因此，蚊虫被认为是唯一的登革热传播媒介。在过??去的几十年里，广州每年都有散发性流行病发生，ＤＥＮＶ－１成为了主要流行毒株，??１９７８年至今累计登革热病例７０余万例，占全国总病例数９０％以上［６，?７］，更是发??生过历史上三次登革热大爆发（１９８０

??｜?ｉ?□?２＿?ｎ?■丨．??ｉ?Ｔ?Ｅ＾ｐ，?Ｕ?Ｈ?１??Ｉ?ｏｉ?．?ｆ?ｉｔ．?ｎｉｌｎ．?Ｊｉ?Ｊ??ｉＴ＾Ｔ，ｎｎｉｕｍ?ｉｉｉｉｉｉｎｉｉｉｉ?關〇圓??ｕ?－ｇ?＜?ｍ?ｏ?ｑ?ｕｊ?ｇ?－ｇ?＜?ｍ?ｏ?ｑ?ｌｕ?＾?－ｇ?＜?ｍ?ｏ?ｑ?ｕｊ?＾?－ｇ?＜?ｍ?ｏ?ｑ?ｕｊ?ｇ??１１１１１１°?１１１１１１°?１１１１１１°?ｌｌｉｌｌｌＱ??图１．１病毒在人源细胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）中复制能力的差异??１．２相同剂量的登革病毒感染蚊虫细胞Ｃ６／３６，荧光定量ＰＣＲ检测ＤＥＮＹ１??ＲＮＡ的拷贝数??为了进一步了解病毒在中间宿主白纹伊蚊中的复制能力的差异。同理，我们??是采用相同剂量的病毒感染白纹伊蚊细胞Ｃ６／３６，分别于感染后１２?ｈ、２４?ｈ、４８??７２?ｈ后，收集上清以及裂解细胞，利用Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ?ＰＣＲ分析病毒ＲＮＡ复制量，??果也显示ＤＥＮＶ１Ｂ、ＤＥＮＶ１Ｃ早期复制得比ＤＥＮＶ１Ｄ和ＤＥＮＶ１Ｅ快（图１．２）。??＞．?Ｉ??

的乳鼠约１０－１１?ｄ开始出现上述症状，最终死亡；接种ＤＥＮＶ１Ｃ的乳鼠约１１－１２?ｄ??开始出现上述症状，最终死亡；而接种ＤＥＮＶ１Ａ、ＤＥＮＶ１Ｄ、ＤＥＮＶ１Ｅ的乳鼠发??病的时间较晚，约１３－１５?ｄ才开始出现症状。结果如图１．３所示：??１〇〇１?—￣［ｐｔ］?“?ＰＢＳ（ｎ＝７）??？?８０－?Ｌ，?ＤＶ１－Ａ（ｎ＝２０）??Ｉ?Ｌ?＂Ｔ??ＤＶ１－Ｂ（ｎ＝２５）??＝６０＇?１?－＊？?ＤＶ１－Ｃ（ｎ＝２８）??ＤＶ１－Ｄ（ｎ＝２４）??〇?Ｉ?Ｉ?ＤＶ１－Ｅ（ｎ＝２７）??＾?２０－?｜??＿?ＤＥＮＶ２（ｎ＝２９）??〇－?１１￣Ｉ?Ｉ??６?５?１０?１５?２０??Ｄａｙｓ?ｐｏｓｔ?ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ??图１．３乳鼠颅脑接种ＤＥＮＶｌ后的生存曲线??１．４接种ＤＥＮＶ１后乳鼠颅脑中的病毒复制量??同时，将乳鼠颅脑匀浆，提取组织ＲＮＡ，荧光定量ＰＣＲ分析乳鼠颅脑中病毒??ＲＮＡ的载量。数据结果与生存曲线一致：ＤＥＮＶＩＢ、ＤＥＮＶ１Ｃ的病毒载量比??ＤＥＮＶ１Ｄ?和?ＤＥＮＶ１Ｅ?的高（图?１．４）。??９??
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本文编号：2892093