不同比例成纤维细胞对骨髓间充质干细胞、内皮细胞、成纤维细胞构建组织工程真皮细胞膜片的影响

发布时间：2020-11-20 23:12

　　研究目的:大面积的烧伤、软组织创伤和皮肤坏死性疾病会造成真皮缺损,严重影响患者的生存质量。组织工程真皮为修复缺损真皮提供了可能。真皮内存在大量的真皮成纤维细胞和脐静脉内皮细胞,本实验旨在研究骨髓间充质干细胞、脐静脉内皮细胞、真皮成纤维细胞在什么样的比例下联合培养可以形成组织工程真皮,以助于未来组织工程真皮的构建。方法:(1)原代人真皮成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞的复苏、体外培养以及形态学观察:10mg/ml poly-L-lysine包被培养瓶,水浴、复苏原代细胞,倒置相差显微镜下观察细胞形态和生长情况,选取生长活性较好的细胞用于实验。(2)兔骨髓间充质干细胞的提取、分离、纯化、体外培养以及形态学的观察:无菌条件下提取两周龄新西兰大白兔双后肢骨髓,运用全骨髓贴壁法对骨髓间充质干细胞进行分离、纯化,显微镜下观察细胞的形态和生长情况,选取生长活性较好的第三代细胞用于以下实验。(3)兔骨髓间充质干细胞、人脐静脉内皮细胞、人真皮成纤维细胞的联合培养构建细胞膜片:将兔骨髓间充质干细胞以9×10?cells/cm2的密度接种于六孔板中连续培养14天,将人脐静脉内皮细胞以5×10?cell/cm2的密度接种在先前的干细胞膜片上,同时将人真皮成纤维细胞以总细胞数的0%、40%、60%、80%的比例接种在干细胞膜片上,进行同一条件下的培养。(4)细胞膜片生长情况以及形态学的观察:1、3、7、14天时显微镜下观察三种细胞形成细胞膜片的生长情况。(5)细胞膜片厚度的测量:取1、3、7、14天的细胞膜片包埋、制作冰冻切片,HE染色,显微镜下观察并拍照,标尺重复测量膜片厚度。(6)免疫荧光染色及观察:取1、3、7、14天各组的细胞膜片做CD31的免疫荧光染色,倒置荧光显微镜下观察内皮细胞血管网络的形成并拍照。(7)免疫组化染色:取1、3、7、14天各组的细胞膜片做Ⅰ型、Ⅲ型胶原的免疫组化染色,倒置显微镜下观察并拍照,IPP6.0图像分析软件计算Ⅰ型、Ⅲ型胶原的含量。(9)流式细胞仪鉴定兔骨髓间充质干细胞:取7天各组的细胞膜片用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液,CD90染色,流式细胞仪的检测。(10)用spss23软件对所得数据结果进行单因素方差分析以及t检验。实验结果:(1)原代人脐静脉内皮细胞和人真皮成纤维细胞复苏后生长活性较高,形态良好。(2)通过全骨髓贴壁法获取的兔骨髓间充质干细胞形态呈均一的长梭形或多角形,增殖旺盛。(3)1、3、7、14天各组的细胞膜片随着时间和成纤维细胞比例的增加,细胞排列由疏松有序变得杂乱紧密,细胞间无空隙,第7天时成纤维细胞60%和80%组、第14天时40%和60%组细胞排列杂乱,编织成致密的网络状。(4)免疫荧光染色结果:随着培养时间和成纤维细胞比例的增加,1、3、7、14天各组细胞膜片中内皮细胞形成的血管网络变得密集,第7天、第14天时成纤维细胞60%、80%组内皮细胞形成的管腔状结构最为典型。(5)免疫组化染色结果:随着培养时间和成纤维细胞比例的增加,细胞膜片中的Ⅰ型胶原含量呈现出先增加后减少的趋势,在第7天时成纤维细胞60%、80%组最接近人类真皮Ⅰ型胶原的含量。类似的,随着培养时间和成纤维细胞比例的增加,细胞膜片中的Ⅲ型胶原含量也呈现出先增加后减少的趋势,在第1天和第7天时成纤维细胞60%、80%组最接近人类真皮Ⅲ型胶原的含量。(6)流式细胞仪鉴定结果:在7天的各组细胞膜片中均有CD90标记的干细胞出现。结论:人脐静脉内皮细胞、兔骨髓间充质干细胞和人真皮成纤维细胞以5:9:21(即成纤维细胞60%组)的比例联合培养形成的细胞膜片在培养第7天时具有真皮的部分属性。
【学位单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R329.2
【部分图文】：

人真皮成纤维细胞,相差显微镜,形态

图 2 人真皮成纤维细胞的形态（倒置相差显微镜）图注：a 图为原代人真皮成纤维细胞，细胞呈短梭形、长梭形、多角形和不规则形；b 图为第 3 代人真皮成纤维细胞，细胞形态呈均一的长梭形，少量呈多角形和不规则形，呈旋涡状、平行状、集落样生长（Scalebar=200um ）。3.2 人脐静脉内皮细胞的形态学和生长情况的观察

人脐静脉内皮细胞,相差显微镜