间充质干细胞逆转大鼠衰老的作用

发布时间：2020-11-21 07:58

　　 背景与目的 中国正快速步入老龄化社会,目前中国60岁以上老年人有约1.69亿。预计2050年中国60岁以上老年人将占三成,老龄化带来的种种困扰和问题更加严重。衰老和死亡是任何物种的个体都难以避免的最终结局,但至今我们对衰老发生机制的理解还相当有限。鉴于其重要性,衰老一直是生物学研究的热点。 经过多年的研究,现在关于衰老的机制已经提出多种学说,每种学说都有其优势和不足。诸如自由基学说、遗传程序学说、差错灾难学说、交联学说、脂褐素累积学说、内分泌功能减退学说等,分别从不同的角度探讨了衰老发生的机制和对策。近50年的理论和实验证实,自由基学说是最有说服力的衰老学说之一。 给动物连续注射D-半乳糖后,因其代谢产物半乳糖醇不能进一步代谢而堆积在细胞内,导致细胞肿胀,致使动物组织细胞出现衰老的退行性变以及功能的改变。同时D-半乳糖在体内产生的大量自由基超过机体的清除能力,引发脂质过氧化的链式反应,产生大量的脂质过氧化物丙二醛,加重对细胞的损伤。D-半乳糖致衰老动物模型的造模方法简便易行,价格低廉,结果稳定,目前已成为国内公认的衰老动物模型。因此本实验采取D-半乳糖制备亚急性衰老模型。 骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是来源于胚胎发育早期中胚层的一类多能干细胞,是全身结缔组织的干细胞。大量实验证实MSCs在合适的体外分化条件下,不仅可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、肌肉细胞等间质细胞,而且可以跨胚层分化为外胚层的神经元、神经胶质细胞和内胚层的肝细胞。并且MSCs具有移植后不发生排斥反应的特点。随着对MSC的深入研究,目前认为MSCs除了具有多向分化潜能,还能在损伤局部反应性分泌多种神经营养因子。这些因子能够促进局部血管增生、组织再生等,从而起到了治疗损伤的作用。 近年来随着对衰老的深入研究,目前认为衰老是一种与基因相关的疾病,已经发现某些基因与细胞衰老密切相关。它们可概括为细胞周期调控基因、端粒酶调控基因、生长抑制蛋白基因、DNA/蛋白质合成与修复基因等。衰老还与 一些转录因子(反式作用因子)的基因表达或活性改变有关。其中具有细胞增殖调控功能的衰老有关基因有抑癌基因p21、抑癌基因p16、抑癌基因p53、细胞周期素D1 (cyclin D1)、周期素依赖性激酶2 (cycli-n-dependent kinase 2,CDK2)、视网膜神经母细胞瘤蛋白(Rb)、增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)、转录因子(A-P-1 E2F)等。这些基因之间相互联系,可能构成细胞衰老的基因调控链。所以本课题将初步探讨MSC是否会影响p16、p21及PCNA的表达,这可能是间充质干细胞发挥抗衰老作用的机制之一 综上所述,我们拟在研究间充质干细胞逆转衰老的作用,并且从衰老相关基因来探讨MSCs抗衰老的机制。本研究将为间充质干细胞发挥抗衰老提供理论与实践基础。如能取得预期效果,经过良好设计的基础研究后,其临床前景广阔。 实验方法 第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定 用贴壁培养法分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,为MSCs的生物治疗奠定基础。无菌条件下取大鼠股骨和胫骨,收集细胞悬液。离心后加入含10%胎牛血清的L-DMEM培养基,接种于培养瓶中,置于培养箱中培养。待贴壁细胞生长达80-90%融合时传代。取生长良好的P3代MSCs进行检测： ①观察MSCs形态并做苏木精-伊红染色。 ②MTT法和克隆形成实验测定生长曲线和克隆形成能力； ③流式细胞仪检测MSCs细胞表面抗原标记和细胞增殖周期； ④在地塞米松、左旋VitC、β-磷酸甘油等作用下向成骨细胞诱导分化；在地塞米松、重组人胰岛素的作用下向脂肪细胞诱导分化。 第二部分制备衰老模型,研究间充质干细胞在衰老大鼠体内的迁移。 ①衰老模型的制备选用清洁级SD大鼠,每日皮下注射D-半乳糖400mg/kg,连续注射4个月,制作衰老模型。取大鼠血清,测定各组大鼠血清中SOD活性和MDA含量。 ②分别从青年对照组和衰老模型大鼠的骨髓中培养出间充质干细胞(MSCs)。倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况,流式细胞术(FCM)检测表面抗原,比较两组原代细胞集落形成数量和增殖情况,透射电镜观察其形态和结构变化。 ③体外培养纯化大鼠骨髓间充质干细胞至第三代,用表达绿色荧光蛋白(GFP)的病毒载体转染MSCs细胞,在显微镜下观察未转染MSCs和转染MSCs的形态并在荧光显微镜下观察GFP表达情况,检测MSCs-GFP的细胞活性和细胞周期,通过流式细胞仪检测GFP对细胞表面标志(CD29, CD34, CD44, CD45)表达的影响。 ④调整GFP标记间充质干细胞浓度为3×107/mL,将3×106个MSCs通过尾静脉回输给衰老大鼠,应用荧光显微镜检测MSCs的迁移。 第三部分间充质干细胞逆转衰老的效果 SD大鼠30只,随机均分为3组：对照组、衰老模型组和MSCs治疗组。衰老模型组大鼠每日皮下注射D-半乳糖400mg/kg,连续4个月。MSCs治疗组在衰老模型制备成功后,给予尾静脉输注3×106个MSCs。 ①实验结束后,取大鼠血清,测定各组大鼠血清中SOD和MDA；全自动分析仪及酶标仪检测雌二醇(E2)、孕酮(P)、促黄体生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)、睾酮(T)；以及血钙(Ca)、碱性磷酸酶(ALP)。 ②取各组大鼠胸腺、脾脏、卵巢和睾丸,HE染色后,观察各组织结构的差异。 ③称重法测定大鼠胸腺指数和脾脏指数；用MTT法测定脾脏淋巴细胞增殖活性；ELISA法测定胸腺IL-7.IL-10和IL-2含量,以及脾脏IL-10和IL-2的含量；流式细胞仪检测胸腺中CD4+CD8+T细胞；透射电镜检测胸腺组织结构。 ④骨密度扫描仪测量各组大鼠骨密度(BMD)；利用扫描电镜对大鼠股骨远端松质骨的形态结构进行观察。 第四部分MSCS治疗衰老的机制研究 实验结束时,处死各组大鼠,无菌条件下提取各个组织,应用Real-time PCR检测各组织中P16、P21和PCNA mRNA的表达。应用免疫印记法检测各组织中P16、P2、PCNA蛋白的表达。 统计学方法 试验资料结果用均数±标准差(x±S)表示,显著性标准为0.05,采用SPSS17.0统计软件进行统计分析。组间比较用单因素方差分析(One-Way ANOVA)；组间两两显著性比较方差齐采用LSD法,方差不齐用Dunnett's T3和Dunnett's C法；分析各因素的主效应和交互效应用析因方差分析；重复测量数据用重复测量方差分析；两个独立样本的总体均数比较用独立样本t检验。 结果 第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定 利用贴壁筛选的方法分离大鼠骨髓MSCs,经传代后细胞形态呈梭形,均匀一致。将P3代细胞低密度接种到培养板,培养1周后可形成散在分布的克隆。细胞生长曲线分析结果显示接种后第三天细胞进入指数增长期,至第五天进入平台期。MSCs细胞周期检测结果显示G0+G1期的细胞约占80%以上。流式细胞仪检测显示P3代细胞均一地表达细胞表面抗原CD44、CD29,不表达CD34和CD45。经定向诱导分化后,细胞分别呈现成骨细胞、脂肪细胞的表型特征。 第二部分制备衰老模型,研究间充质干细胞在衰老大鼠体内的迁移。 ①成功制备了D-半乳糖致亚急性衰老大鼠模型。与对照组相比,衰老模型组SOD的活性明显降低,MDA含量明显降低升高,差异有显著性意义(P0.01)。 ②青年组和衰老模型组的原代和第3代骨髓间充质干细胞在形态上无差异；流式细胞仪检测显示,两组MSCs的免疫表型一致；两组细胞也都具有成骨诱导和成脂诱导能力。但与青年对照组相比,衰老模型组MSCs生长速度明显减慢,集落形成单位明显降低(P0.05)。透射电镜观察发现,衰老模型组MSCs呈现衰老的形态和结构变化。 ③GFP转染后24 h即可见绿色荧光蛋白表达,72 h表达最强,此后逐渐减弱,到4周时仍可见少量表达。并且GFP对MSCs细胞的增殖、细胞形态、周期及表面抗原的表达均无影响。 ④绿色荧光蛋白标记MSCs回输到衰老大鼠体内,MSCs能够归巢到衰老大鼠的胸腺、脾脏、卵巢、睾丸。MSCs归巢到衰老大鼠体内第7天时,归巢的组织仍有荧光存在。 第三部分间充质干细胞逆转衰老的效果 ①与衰老模型组相比,MSCs治疗组SOD的活性明显升高,MDA含量明显降低,差异有显著性意义(P0.05)。酶标仪检测雌性大鼠血清中激素的水平,结果显示,MSCs治疗组与模型组相比,能够升高大鼠体内P、E2及睾酮的含量；能够降低LH、FSH的含量(P0.05),差异具有统计学意义。各组大鼠的血清钙、碱性磷酸酶含量测定结果：与正常对照组比较,衰老模型组血清钙和ALP有所升高(P0.05)；而MSCs治疗组与致衰老模型组相比,血清钙、ALP则明显降低(P0.05)。 ②MSCs治疗组与模型组相比,能使胸腺、脾脏、睾丸和卵巢的结构得到明显改善：于100倍光镜下检测睾丸中不同萎缩程度曲细精管的百分比。结果显示,治疗组与模型组相比,能够提高正常生精管的比例,减少部分萎缩管及完全萎缩管的比例(P0.05)。与模型组相比,治疗组的卵巢中黄体和卵泡数目增多(P0.05),组间比较,差异具有统计学意义。 ③间充质干细胞可增强衰老模型大鼠的免疫功能,显著提高衰老大鼠的胸腺指数和脾脏指数,增强T淋巴细胞活性,同时增加IL-2和IL-7的表达水平；降低IL-10的表达水平。衰老模型组CD4+CD8+T细胞的百分数明显低于对照组；治疗组与模型组比较,其百分数明显升高,差异具有显著性(P0.01)。胸腺组织的透射电镜分析结果：MSCs治疗组与模型组相比,能使胸腺组织结构得到明显改善。 ④骨密度扫描仪测量骨密度(BMD):MSCs治疗组与致衰老模型组相比,全身BMD有所升高(P0.05),股骨BMD明显升高(P0.05)。扫描电镜结果显示：与对照组相比,模型组大鼠的骨小梁变细,断裂,数量减少,微损伤增多；而治疗组与模型组大鼠相比,骨小梁数量增加,骨吸收面减少,胶原纤维排列规律、整齐。 第四部分MSCS逆转衰老的机制研究 Real-time PCR检测各组织中P16、P21和PCNA mRNA的表达结果显示：与模型组相比,治疗组中大鼠各组织内P16和P21 mRNA的表达降低,而PCNA mRNA的表达升高(P0.05)。Western blot结果显示：治疗组P16及P21蛋白表达低于模型组；而PCNA蛋白表达明显高于模型组。 结论 1.本实验建立了一种体外稳定培养扩增大鼠MSCs的方法,培养的细胞成分单一,通过观察细胞生物学特性、流式细胞仪测定细胞表面抗原结果符合MSCs标准。适用于对BMSCs进一步的应用研究。 2.衰老模型组的间充质干细胞的数目和功能都发生了改变,推测随着大鼠衰老,MSCs细胞可能也会随着衰老。因此移植青年大鼠MSCs对移植治疗会有更好的效果。 3.GFP荧光稳定持久,对转染细胞的生物学特征无明显影响,并且其荧光表达时间达4周,因此可以将其作为间充质干细胞的示踪标记。经尾静脉移植的MSCs能够较长时间定位于衰老大鼠的各器官。 4.本实验从功能水平、生化水平及细胞水平检测,发现间充质干细胞能够修复衰老所致大鼠组织的损伤,具有治疗大鼠衰老的作用。 5.MSCs可明显下调p16和P21,上调PCNA的表达,可能是其逆转衰老的机制之一。 本研究的创新点 1.对免疫系统、骨质疏松的作用：间充质干细胞可增强老年大鼠免疫功能；MSCs细胞可以修复D-半乳糖所致骨质疏松症。 2.衰老模型大鼠MSCs的生长速度和增殖能力发生了改变,因此移植青年大鼠MSCs作为种子细胞,对移植治疗会有更好的效果。 3.通过Real-time PCR和免疫印迹方法,发现MSCs可明显下调p16和P21,上调PCNA的表达,这些基因之间可能相互联系,构成细胞衰老的基因调控链。MSCs可能通过抑制p16和P21的表达,促进细胞周期从G1期向S期进展；另一方面,MSCs可能通过抑制P21,进而释放PCNA蛋白,推进DNA合成、增殖。最终逆转组织细胞衰老。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2011
【中图分类】：R363
【部分图文】：

图l一5P3代MSCS(xl00)Fig.l一5Passage3ofMSCs(xl0o)图A:P3代MSCs细胞形态均一，呈长梭性，不再以集落方式生长而呈均匀的纺锤形生长分布;图B:P3代MSCS细胞的HE染色。

图l一5P3代MSCS(xl00)Fig.l一5Passage3ofMSCs(xl0o)图A:P3代MSCs细胞形态均一，呈长梭性，不再以集落方式生长而呈均匀的纺锤形生长分布;图B:P3代MSCS细胞的HE染色。

将P3代细胞低密度接种到培养板，培养1周后可形成散在分布的克隆。第14天的CFU一F为(22.6士2.4)(图l一8，1一9)。图1一8.Mscs形成的细胞克隆(科0)图1一9.Mscs细胞克隆的吉姆萨染色(x40)Fig.1一 8TheelonesofMSCs(X40)Fig.l一 9TheclonewasmeasuredbyGiemsa， 5staining(X40) 4.5MSCs细胞的鉴定利用FCM检测培养的P3代骨髓间充质干细胞表面标记物，实验结果发现，CD29阳性细胞达到99.9%;CD44阳性细胞数达到97.8%;CD34和CD45阴性细胞数分别为993%、99.1(图1一10)。
【参考文献】

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本文编号：2892768