背景及目的烟曲霉(Aspergillus fumigatus,A.fumigatus)是一种广泛存在于我们生活环境中重要致病菌,可以引起人类、畜及禽类的感染,最常见的感染是肺部感染。A.fumigaius可以产生分生孢子,直径只有2-3μm,被吸入肺部后,可到达肺泡,随后出芽,产生菌丝,侵犯肺组织。肺部感染可因宿主免疫状态、肺部疾病状况、吸入烟曲霉总量及频率的不同,产生不同类型的感染,如侵袭性曲霉菌病(invasive pulmonary aspergillosis,IA)、慢性肺曲霉菌病(chronic pulmonary aspergillosis,CPA)、变应性支气管肺曲霉菌病(allergic bronchopulmonary aspergillosis,ABPA)等。其中,IA及ABPA已有较多研究,其发病机制及治疗方法也比较明确,而由于缺少动物模型,CPA的发病机制及治疗手段研究较少。CPA主要发生于免疫力正常但有基础肺病(肺结核)或有轻度免疫力下降的患者。CPA死亡率非常高,已成为全球范围内威胁人类健康的疾病。因此,建立CPA的动物模型势在必行。之前已有学者尝试着建立CPA的模型,他们通过将包裹在琼脂球中的A.fumigatus孢子接种至小鼠肺部,使之不易被清除,建立了长达28天的肺部烟曲霉感染模型。然而,在这个模型中,包裹在琼脂球中的烟曲霉无法与免疫细胞进行充分的接触,且琼脂本身可引起肺部的免疫反应,这两点使得他们所检测的免疫反应出现较大的偏差。在2015年,我们实验室曾经从一名有肺结核病史的CPA患者肺组织中分离出了一株不产孢、只有菌丝形态的烟曲霉。此外,由于在CPA病程中,A.fumigatus也主要是以菌丝形态慢性定植于小鼠肺部,因此建立肺部A.fumigatus菌丝慢性定植的动物模型,对于研究CPA的发病机制及治疗手段的评价具有重要参考意义。此外,既往有研究证明,A.fumigatus孢子及菌丝形态可引起不同的免疫反应,但是研究结果具有较大争议。因此,我们将建立肺部A.fumigatus菌丝的慢性定植模型来模拟人类CPA。另外我们以小鼠肺部A.fumigatus的孢子感染为对照,研究A.fumigatus孢子及菌丝引起不同的固有免疫及适应性免疫反应。实验方法本研究用绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标记A.fumigatus标准菌株Af293,并将其制作成为直径在150-250 u m的结构紧密的菌丝球,接种至免疫力正常的小鼠肺部,并通过小鼠肺部活体成像、小鼠肺部病理(PeriodicAcid-Schiff stain,PAS染色)及小鼠肺部真菌负荷检测Af293在小鼠肺部存留时间,判断小鼠是否为慢性感染。同时监测小鼠体重变化,及一般情况变化,如大小便性状变化、毛发变化、肺部症状。利用流式细胞仪检测小鼠肺部A.fumigatus孢子及菌丝形态感染引起的不同免疫反应。实验结果1.GFP 标记 Af293 菌株(Af293-GFP)将GFP基因序列转染至Af293菌株的基因序列中,使Af293菌株带有明亮的绿色荧光,且在小鼠体内28天不会淬灭。2.Af293-GFP菌丝球的制作将Af293-GFP菌丝制作成为结构紧密的菌丝球,其直径为150-250 μm。3.小鼠肺部Af293-GFP分布在对照组,小鼠肺部无荧光;在肺部感染孢子组,小鼠肺部在感染后第1,7天可见绿色荧光,7天之后无荧光;在肺部感染菌丝球组,小鼠肺部在感染后1,7,14,21及28天均可见绿色荧光:在感染后第1天及第7天,小鼠肺部荧光较强;从第14天至21天,小鼠肺部荧光一直较弱;而在感染后第28天,小鼠肺部荧光明显强于第14天及第21天,且荧光明显变得弥散。4.小鼠肺部病理结果(PAS染色)在孢子感染组,感染后第1天,病理结果可见烟曲霉Af293孢子被巨噬细胞吞噬;感染后第7天,病理结果显示气管腔内大量品红色气管分泌物;感染后14、21及28天,小鼠病理结果均未见明显异常。在菌丝球感染组,菌丝可在小鼠肺部存留长达28天。在小鼠感染菌丝球后第1天,大量的中性粒细胞及巨噬细胞均被募集至感染区;在感染后第7天,气管腔内的菌丝球生长为较大的菌丝块,充满支气管管腔,菌丝块内有大量的中性粒细胞及巨噬细胞浸润;在感染后第14、21天,管腔内大部分烟曲霉菌丝已被清除,且气管腔壁已被破坏,感染区被大量巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞包饶;感染后第28天,感染区为大量中性粒细胞、巨噬细胞及淋巴细胞浸润,肺部出现实变。各个时间点感染病灶局限,均未见菌丝侵袭肺间质及肺部血管。这与人类CPA病理表现相类似。5.小鼠肺部真菌负荷在孢子感染组,小鼠肺部真菌负荷逐渐减少。在菌丝球感染组,小鼠肺部真菌负荷在感染后第1天及第7天几乎维持不变,表明了小鼠肺部烟曲霉在被炎症细胞吞噬的同时,也有一定的生长;在感染后第14、21天,小鼠肺部真菌负荷维持不变,但相较于第7天明显下降;而在感染后第28天,小鼠肺部真菌负荷有了较大的增长,表明了小鼠肺部真菌感染出现了复燃,这与人类CPA具有高复发率相吻合。6.小鼠体重变化及一般情况观察未感染组、孢子感染组及菌丝球感染组的小鼠体重变化趋势无明显差异。三组小鼠均未出现大小便性状变化、皮毛杂乱及喘息等呼吸道症状。此外,三组小鼠在接种24小时之后,均未出现死亡。7.固有免疫研究结果固有免疫主要探究了巨噬细胞及中性粒细胞在烟曲霉感染中的作用。在孢子感染组,接种后支气管腔内出现大量巨噬细胞及少量的中性粒细胞,且在感染后第7天,两种细胞数量达到最大值,之后则逐渐降低。在管腔周围,整个感染过程中均未见巨噬细胞及中性粒细胞浸润,而在感染后第28天,管腔周围有少量淋巴细胞浸润。在菌丝球感染组,感染后支气管腔内聚集有大量巨噬细胞及中性粒细胞,且在感染后第7天数量达到最大值,随后逐渐降低。在管腔周围,同样有大量巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞浸润。其中,巨噬细胞及淋巴细胞在感染后第1天数量达到最大值,其后即逐渐下降。而中性粒细胞数量在感染后第7天达到顶峰,其后逐渐下降。8.适应性免疫研究结果在孢子感染组,Th1、Th2及Th17细胞数量均从感染后第1天开始增加,至第7天达到最大值,之后逐渐下降,但仍高于未感染组。这与既往研究结果不相符,而从感染后第1天至第21天,孢子感染组Treg细胞均高于未感染组。在菌丝球感染组,在整个感染过程中,Th1细胞均未见升高,而Th2及Th17细胞在感染后第7天有一过性的升高,后逐渐降低。Treg细胞在感染后第1天即升高,在第7天达到最大值,随后逐渐降。结论本研究建立了一个肺部A.fumigatus菌丝慢性定植的小鼠模型来模拟人类CPA,为研究CPA的发病机制及新的治疗方法提供了动物模型,也为不产孢烟曲霉引起的CPA的研究提供了动物模型。此外,此研究也探讨了烟曲霉孢子及菌丝引起的不同的免疫反应。
【学位单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R519;R-332
【部分图文】：
－２０°Ｃ储存。??３．实验结果??３．１插入ＧＦＰ片段引物扩增产物琼脂糖凝胶电泳（见图２．１），?ＤＮＡ片段长７７９ｂｐ。??■??图２．１插入ＧＦＰ片段引物扩增产物，ＤＮＡ长度为７７９ｂｐ。??３．２转化后大肠杆菌菌落ＰＣＲ产物琼脂糖凝胶电泳（见图２．２），ＤＮＡ片段长??１５２５ｂｐ。可见所挑选的１２个菌落均转化成功。??ＢＢＢ８Ｉ??图２．２?１２个转化后大肠杆菌菌落ＰＣＲ扩增产物，ＤＮＡ长度为１５２５ｂｐ。??３．３荧光显微镜下ＧＦＰ阳性／１只９３菌株Ｕ／２９３－ＣＦＰ）（见图２．３），可观察到??Ｚ１／２９３－ＧＦＰ菌株的孢子及菌丝均带有较强的绿色荧光。??４１??
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