肠道病毒71型及单纯性疱疹病毒2型的抗病毒药物的作用研究
发布时间：2020-11-22 08:29
【摘要】：肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)是重症或致死性手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)的主要病原体,能够入侵中枢神经系统(Central nervous system,CNS),造成永久性的损伤。目前,临床上的主要治疗方法为对症治疗及静脉注射免疫球蛋白,尚无针对EV71感染可用的抗病毒药物。因此,开发安全有效的EV71的抗病毒药物具有重要意义。Retro-2~(cycl)是通过细胞高通量筛选(High-throughput screening,HTS)的方法得到的蛋白毒素抑制剂,对多种病原体的抑制活性相继被报道。Retro-2~(cycl)通过靶向阻断细胞囊泡运输(Intracellular vesicle transport)而对利用这一过程的病原体发挥抑制作用。细胞囊泡运输参与了EV71生命周期中包括非裂解性释放(Non-lytic release)的数个重要过程,为Retro-2~(cycl)以及其活性衍生物Retro-2.1作为EV71潜在的抗病毒药物的研究提供了可行性。因此,本论文对Retro-2~(cycl)及Retro-2.1对EV71的抗病毒作用进行了研究。黄酮类化合物(Flavonoids)是一类具有相同母核的小分子化合物,有多种生物活性。其中,数种黄酮类化合物对EV71的抗病毒活性已经被相继报道。然而,这些报道来自于不同研究体系,限制了化合物间横向比较的可能性;此外,这些报道仅限于细胞水平的研究,而动物模型的有效性是验证药物发展潜力的重要指标。因此,本论文对代表性黄酮类化合物对EV71的抗病毒活性进行了研究。单纯性疱疹病毒2型(Herpes simplex virus type 2,HSV-2)是引起生殖器疱疹的主要病原体,并具有终身潜伏性;HSV-2还能够增加感染人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)以及罹患宫颈癌的风险。临床上的主要治疗方法为基于阿昔洛韦(Acyclovir)或其前药的化学疗法;然而,耐药性以及严重的毒副作用限制了阿昔洛韦的使用。目前,在研的化合物多数由于毒副作用而被迫停止研究。因此,开发安全有效的替代性HSV-2的抗病毒化合物迫在眉睫。ABMA是通过细胞高通量筛选(High-throughput screening,HTS)的方法得到的另一类蛋白毒素抑制剂,并对多种病原体具有抑制活性。ABMA通过靶向宿主细胞内吞转运(Host-endosomal trafficking)而发挥抑制作用,而细胞内吞转运属于细胞囊泡运输(Intracellular vesicle transport)的范畴,参与了HSV-2生命周期中包括内吞进入(Endocytic entry)及包膜包封(Envelopment)的数个重要过程,为ABMA作为HSV-2潜在的抗病毒药物的研究提供了可行性。因此,本论文对ABMA对HSV-2的抗病毒作用进行了研究。本研究分为以下三个部分:第一部分:Retro-2~(cycl)和Retro-2.1对EV71的抗病毒作用研究首先,我们建立了EV71的293S细胞感染模型,基于此模型通过细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE)及病毒空斑(Plaque formation)效应实验,得到Retro-2~(cycl)和Retro-2.1的选择性指数分别为:39.81和5356。随后,我们通过检测不同的给药方式对抑制活性的影响,发现Retro-2~(cycl)及Retro-2.1的有效作用阶段为EV71生命周期的晚期阶段,可能阻断了子代病毒的包装或释放;在EV71子代病毒包装及释放阶段(5–16 h)给药,发现细胞外病毒滴度降低,而细胞内病毒滴度升高,证明Retro-2~(cycl)及Retro-2.1是通过阻断子代病毒的释放而发挥作用的;此外,还在细胞免疫荧光实验中发现,Retro-2~(cycl)和Retro-2.1将EV71由细胞膜下的累积转变为细胞质中的均匀分布,直观地验证了该抑制作用。最后,我们建立了EV71的BALB/c乳鼠致死感染模型,对Retro-2~(cycl)对EV71的体内抗病毒效果进行评价(由于Retro-2.1的水溶性较低,仅对Retro-2~(cycl)进行了体内实验,提高Retro-2.1水溶性的优化正在进行中);发现Retro-2~(cycl)在10 mg/kg的剂量下,能够使致死剂量EV71感染的乳鼠的生存率提高至90%。综上所述,该部分研究证明了Retro-2~(cycl)及Retro-2.1为EV71的体内外有效制剂,并初步阐明了其作用机制:阻断细胞囊泡运输参与的子代病毒的释放;由于Retro-2~(cycl)的大量衍生物已经被报道,该部分研究可为EV71抗病毒药物的研究提供了先导化合物;由于Retro-2~(cycl)及Retro-2.1的作用靶点为细胞囊泡运输而非病毒本身,降低了产生耐药性的风险;由于Retro-2~(cycl)及Retro-2.1被报道对多种病原体均具有抑制作用,本部分研究进一步地扩大了病原体的范围,为Retro-2~(cycl)及Retro-2.1发展为广谱性药物提供了依据,并且提示:细胞囊泡运输可以作为有效的抗病毒靶点。第二部分:黄酮类化合物对EV71的抗病毒作用研究首先,我们对9种黄酮类化合物的体外活性进行检测,为动物实验的用药剂量提供参考;结果显示,9种化合物的选择性指数均高于4;其中,7-羟基黄酮的治疗指数为12215.79,具有最佳开发潜力。随后,我们选择适宜的剂量对化合物的体内抑制活性进行检测,发现9种化合物均对EV71的体内感染具有显著性的保护作用;其中,7-羟基黄酮在0.2 mg/kg的低剂量下可达到66.67%的保护率,异鼠李素在10 mg/kg的剂量下可达100%的保护率,具有最佳开发潜力。综上所述,该部分研究发现了异鼠李素对EV71的抗病毒作用;证明了9种黄酮类化合物的体内有效性;在同一体系中对9种黄酮类化合物对EV71的抗病毒活性进行研究,为化合物间的比较提供了依据;证明了7-羟基黄酮及异鼠李素为具有较大抗EV71潜力的黄酮类化合物。第三部分:ABMA对HSV-2的抗病毒作用研究首先,我们建立了HSV-2的Vero细胞感染模型,基于此模型通过细胞病变(Cytopathic effect,CPE)及病毒空斑(Plaque formation)效应实验,得到了ABMA的选择性指数为:20.93;并通过基于病毒水平的核酸及蛋白含量检测验证了其有效性。随后,我们通过检测不同的给药方式对抑制活性的影响,发现ABMA对HSV-2的有效作用阶段为生命周期的早期及晚期阶段;通过病毒的吸附与进入实验,发现ABMA作用于HSV-2早期阶段的进入过程,并在细胞免疫荧光实验中发现,ABMA将HSV-2由细胞核内及核周分布转变为细胞膜外分布,直观地证明了该抑制作用;此外,通过在HSV-2晚期阶段(6–18 h)给药,发现细胞内外病毒滴度均显著性地降低,而HSV-2的包装及释放发生在感染5 h之后,是在晚期阶段最有可能被抑制的过程。最后,我们建立了HSV-2的BALB/c雌鼠感染模型,对ABMA的体内抗病毒效果进行评价,ABMA在5 mg/kg的剂量下,使HSV-2生殖道攻毒后的小鼠存活率由8.33%提高至50%。综上所述,该部分研究证明了ABMA为HSV-2的体内外有效抑制剂,并初步阐明了其作用机制为:阻断细胞囊泡运输参与的HSV-2的进入过程及生命周期晚期过程,为HSV-2的抗病毒药物提供了先导化合物;由于ABMA的作用靶点为细胞囊泡运输过程,而非病毒本身,降低了产生耐药性的风险;由于ABMA对多种病原体均具有抑制活性,该部分研究进一步地扩大了病原体的范围,为ABMA发展为广谱性药物提供了依据,并提示:细胞囊泡运输可以作为有效的抗病毒靶点。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R373
【图文】：
第 1 章 Retro-2cycl和 Retro-2.1 对 EV71 的抗病毒作用研究第 1 章 Retro-2cycl和 Retro-2.1 对 EV71 的抗病毒作用研究第 1 节 前言1.1 手足口病简介1.1.1 手足口病临床症状手足口病（Hand, foot and mouth disease, HFMD）以其普遍临床症状命名，主要感染年龄在 5 岁以下的婴幼儿，并通过粪便及鼻咽分泌液传播。该疾病潜伏期为 3 - 7 天，主要症状为发烧、淋巴结肿大，随后 1 - 2 天在手掌、足底及口舌部位出现丘疹或水泡，一般为自愈性[1, 2]。然而，在一些患者中会出现严重的神经系统并发症，如无菌性脑炎、脑干脑炎、脑膜炎、神经性肺水肿、循环系统障碍及弛缓性麻痹，进而导致永久性损伤甚至死亡[3, 4]。
图 1.2 肠道病毒基因组图解上：肠道病毒基因组，下：肠道病毒多聚蛋白加工模式[12]在病毒复制过程中，首先直接翻译产生一个由 2193 个氨基酸组成的多聚蛋白；该多聚蛋白不断地被非结构蛋白 2A 蛋白酶切割形成 P1 和 P2-3 两个前体蛋白[18]，而 P1 进一步地被非结构蛋白 3C 蛋白酶及 3DRNA 聚合酶剪切形成 VP1，VP3 及 VP0，组装形成前体衣壳结构[19]；在 RNA 进入后，VP0 进一步裂解为VP2 及 VP4，VP1-VP3 暴露在衣壳表面形成反向平行的 β-筒状结构，而 VP4 则包裹进入衣壳内，最终形成 60 拷贝的正二十面体。
图 1.2 肠道病毒基因组图解上：肠道病毒基因组，下：肠道病毒多聚蛋白加工模式[12]在病毒复制过程中，首先直接翻译产生一个由 2193 个氨基酸组成的多聚蛋白；该多聚蛋白不断地被非结构蛋白 2A 蛋白酶切割形成 P1 和 P2-3 两个前体蛋白[18]，而 P1 进一步地被非结构蛋白 3C 蛋白酶及 3DRNA 聚合酶剪切形成 VP1，VP3 及 VP0，组装形成前体衣壳结构[19]；在 RNA 进入后，VP0 进一步裂解为VP2 及 VP4，VP1-VP3 暴露在衣壳表面形成反向平行的 β-筒状结构，而 VP4 则包裹进入衣壳内，最终形成 60 拷贝的正二十面体。
【参考文献】
本文编号：2894413
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R373
【图文】：
第 1 章 Retro-2cycl和 Retro-2.1 对 EV71 的抗病毒作用研究第 1 章 Retro-2cycl和 Retro-2.1 对 EV71 的抗病毒作用研究第 1 节 前言1.1 手足口病简介1.1.1 手足口病临床症状手足口病（Hand, foot and mouth disease, HFMD）以其普遍临床症状命名，主要感染年龄在 5 岁以下的婴幼儿，并通过粪便及鼻咽分泌液传播。该疾病潜伏期为 3 - 7 天，主要症状为发烧、淋巴结肿大，随后 1 - 2 天在手掌、足底及口舌部位出现丘疹或水泡，一般为自愈性[1, 2]。然而，在一些患者中会出现严重的神经系统并发症，如无菌性脑炎、脑干脑炎、脑膜炎、神经性肺水肿、循环系统障碍及弛缓性麻痹，进而导致永久性损伤甚至死亡[3, 4]。
图 1.2 肠道病毒基因组图解上：肠道病毒基因组，下：肠道病毒多聚蛋白加工模式[12]在病毒复制过程中，首先直接翻译产生一个由 2193 个氨基酸组成的多聚蛋白；该多聚蛋白不断地被非结构蛋白 2A 蛋白酶切割形成 P1 和 P2-3 两个前体蛋白[18]，而 P1 进一步地被非结构蛋白 3C 蛋白酶及 3DRNA 聚合酶剪切形成 VP1，VP3 及 VP0，组装形成前体衣壳结构[19]；在 RNA 进入后，VP0 进一步裂解为VP2 及 VP4，VP1-VP3 暴露在衣壳表面形成反向平行的 β-筒状结构，而 VP4 则包裹进入衣壳内，最终形成 60 拷贝的正二十面体。
图 1.2 肠道病毒基因组图解上：肠道病毒基因组，下：肠道病毒多聚蛋白加工模式[12]在病毒复制过程中，首先直接翻译产生一个由 2193 个氨基酸组成的多聚蛋白；该多聚蛋白不断地被非结构蛋白 2A 蛋白酶切割形成 P1 和 P2-3 两个前体蛋白[18]，而 P1 进一步地被非结构蛋白 3C 蛋白酶及 3DRNA 聚合酶剪切形成 VP1，VP3 及 VP0，组装形成前体衣壳结构[19]；在 RNA 进入后，VP0 进一步裂解为VP2 及 VP4，VP1-VP3 暴露在衣壳表面形成反向平行的 β-筒状结构，而 VP4 则包裹进入衣壳内，最终形成 60 拷贝的正二十面体。
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 Xiaobo Lei;Sheng Cui;Zhendong Zhao;Jianwei Wang;;Etiology, pathogenesis, antivirals and vaccines of hand,foot, and mouth disease[J];National Science Review;2015年03期
本文编号：2894413
本文链接：https://www.wllwen.com/xiyixuelunwen/2894413.html
