中枢神经系统内Sipl/Smad信号通路在髓鞘生成中的作用
发布时间：2020-12-04 10:21
一.研究目的：研究Smad相互作用蛋白-1（Sipl/Zfhx1b）对少突胶质细胞分化成熟的调节作用,以及发现Sip1的直接作用的下游基因,并探索Sip1/Zfhx1b促进少突胶质细胞分化成熟和启动髓鞘生成作用的分子机制。二.研究方法：1.Sip1/Zfhx1b在少突胶质细胞分化成熟中的作用：（1）免疫染色法测定Sip1在中枢神经系统内少突胶质细胞丰富区域的表达情况；（2）原位杂交技术确定Sip1在脊髓中的发育情况；（3）建立少突胶质细胞内Sip1特异性敲除模型,评价Sip1敲除后小鼠的小鼠表型和生存的影响；（4）Sip1敲除小鼠模型中,免疫染色法和原位杂交技术评价与少突胶质细胞分化成熟的相关标记物的变化情况；（5）电镜下观察Sip1敲除小鼠的髓鞘生成的变化情况；（6）免疫染色法评价体外敲除Sip1基因对少突胶质细胞的影响；（7）Sip1敲除小鼠模型中,原位杂交技术确定OPC的增殖能力的改变情况。2. Sipl/Zfhx1b调控少突胶质细胞分化成熟和启动髓鞘生成作用的分子机制研究：2.1 Sipl/Zfhx1b调控少突胶质细胞分化成熟相关通路的分子机制研究（1）荧光素酶报告基因法确定S...
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：100 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
目次
前言
第一部分 Sip1基因条件下敲除后的表型研究
1.1 实验仪器与材料
1.1.1 仪器
1.1.2 药物与试剂
1.1.3 细胞株和OPC原代培养
1.1.4 实验动物
1.2 实验方法
1.2.1 Sip1条件性敲除小鼠和Olig1突变型小鼠模型构建
1.2.2 质粒构建
1.2.2.1 pCIG-HA-Smad7,pCIG-Flag-Smurf1,pCIG-mSIP1构建
1.2.2.2 lenti-GFP-HA-Smad7,lenti-GFP-mSip1,lenti-GFP—Flag-Smurf1构建
1.2.3 OPC的纯化和分化
1.2.4 组织学和原位杂交
1.2.5 组织和细胞免疫荧光和confocal显微镜
1.2.6 病毒制备
1.2.6.1 腺病毒制备
1.2.6.2 慢病毒制备
1.3 实验结果
1.3.1 Sip1/Zfhx1b在Olig1突变小鼠中显著下降
1.3.2 Sip1表达在脑组织和脊髓少突胶质细胞丰富的区域
1.3.3 Sip1在脊髓腹侧的发育情况
1.3.4 Sip1敲除引起动物的死亡
1.3.5 Sip1敲除能抑制髓鞘基因生成和轴突髓鞘化
1.3.6 OPC生成和增殖不受Sip1敲除的影响
1.3.7 体外敲除Sip1抑制OPC的分化
第二部分Sip1调控少突胶质细胞分化和启动轴突髓鞘化的作用机制研究
2.1 实验仪器与材料
2.1.1 实验仪器
2.1.2 药物与试剂
2.1.3 细胞株和OPC原代培养
2.1.4 实验动物
2.2 实验方法
2.2.1 Sip1条件性敲除小鼠模型构建
2.2.2 质粒构建
2.2.2.1 pCIG-HA-Smad7,pCIG-Flag-Smurf1,pCIG-mSIP1构建
2.2.2.2 lenti-GFP-HA-Smad7,GFP-mSip1,GFP—Flag-Smurf1构建
2.2.3 细胞培养
2.2.4 OPC的纯化和分化
2.2.5 组织学和原位杂交
2.2.6 组织和细胞免疫荧光和confocal显微镜
2.2.7 western blotting和免疫共沉淀
2.2.7.1 western blotting
2.2.7.2 免疫共沉淀
2.2.8 病毒制备
2.2.8.1 腺病毒制备
2.2.8.2 慢病毒制备
2.2.9 荧光素酶报告基因法
2.2.10 染色质免疫共沉淀
2.3 实验结果
2.3.1 Sip1拮抗Smad/BMP信号通路在少突胶质细胞分化过程中的抑制性作用
2.3.1.1 Sip1拮抗磷酸化Smad1在少突胶质细胞分化过程中的抑制性作用
2.3.1.2 Sip1拮抗Id2、4和Hes1的激活
2.3.1.3 Sip1的敲除不改变pSmad1的表达
2.3.1.4 OLs阶段pSmad1连接Sip1和p300形成复合物
2.3.2 Sip1通过影响不同的少突胶质细胞分化的调节因子促进OPC的分化
2.3.3 Sip1调控的髓鞘基因和BMP等相关通路
2.3.4 Sip1调节少突胶质细胞分化相关因子的启动子区域
2.3.5 Smad7是少突胶质细胞内Sip1的下游基因
2.3.5.1 Smad7表达在野生型小鼠脊髓腹侧部的少突胶质细胞内
2.3.5.2 Sip1和Smad7在OLs内表达明显增多
2.3.5.3 Sip1直接调控Smad7的表达
2.3.5.4 Smad7过表达拮抗Sip1基因缺失引起的OPC分化障碍
2.3.6 Smad7协同Smurf1调控BMP和Wnt信号通路
2.3.7 Smad7促进少突胶质细胞相关标记物的异位表达
2.3.8 Smad7敲除能抑制髓鞘基因生成
3 讨论
参考文献
综述
参考文献
作者简介及在读期间所取得的科研成果
本文编号：2897428
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：100 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
目次
前言
第一部分 Sip1基因条件下敲除后的表型研究
1.1 实验仪器与材料
1.1.1 仪器
1.1.2 药物与试剂
1.1.3 细胞株和OPC原代培养
1.1.4 实验动物
1.2 实验方法
1.2.1 Sip1条件性敲除小鼠和Olig1突变型小鼠模型构建
1.2.2 质粒构建
1.2.2.1 pCIG-HA-Smad7,pCIG-Flag-Smurf1,pCIG-mSIP1构建
1.2.2.2 lenti-GFP-HA-Smad7,lenti-GFP-mSip1,lenti-GFP—Flag-Smurf1构建
1.2.3 OPC的纯化和分化
1.2.4 组织学和原位杂交
1.2.5 组织和细胞免疫荧光和confocal显微镜
1.2.6 病毒制备
1.2.6.1 腺病毒制备
1.2.6.2 慢病毒制备
1.3 实验结果
1.3.1 Sip1/Zfhx1b在Olig1突变小鼠中显著下降
1.3.2 Sip1表达在脑组织和脊髓少突胶质细胞丰富的区域
1.3.3 Sip1在脊髓腹侧的发育情况
1.3.4 Sip1敲除引起动物的死亡
1.3.5 Sip1敲除能抑制髓鞘基因生成和轴突髓鞘化
1.3.6 OPC生成和增殖不受Sip1敲除的影响
1.3.7 体外敲除Sip1抑制OPC的分化
第二部分Sip1调控少突胶质细胞分化和启动轴突髓鞘化的作用机制研究
2.1 实验仪器与材料
2.1.1 实验仪器
2.1.2 药物与试剂
2.1.3 细胞株和OPC原代培养
2.1.4 实验动物
2.2 实验方法
2.2.1 Sip1条件性敲除小鼠模型构建
2.2.2 质粒构建
2.2.2.1 pCIG-HA-Smad7,pCIG-Flag-Smurf1,pCIG-mSIP1构建
2.2.2.2 lenti-GFP-HA-Smad7,GFP-mSip1,GFP—Flag-Smurf1构建
2.2.3 细胞培养
2.2.4 OPC的纯化和分化
2.2.5 组织学和原位杂交
2.2.6 组织和细胞免疫荧光和confocal显微镜
2.2.7 western blotting和免疫共沉淀
2.2.7.1 western blotting
2.2.7.2 免疫共沉淀
2.2.8 病毒制备
2.2.8.1 腺病毒制备
2.2.8.2 慢病毒制备
2.2.9 荧光素酶报告基因法
2.2.10 染色质免疫共沉淀
2.3 实验结果
2.3.1 Sip1拮抗Smad/BMP信号通路在少突胶质细胞分化过程中的抑制性作用
2.3.1.1 Sip1拮抗磷酸化Smad1在少突胶质细胞分化过程中的抑制性作用
2.3.1.2 Sip1拮抗Id2、4和Hes1的激活
2.3.1.3 Sip1的敲除不改变pSmad1的表达
2.3.1.4 OLs阶段pSmad1连接Sip1和p300形成复合物
2.3.2 Sip1通过影响不同的少突胶质细胞分化的调节因子促进OPC的分化
2.3.3 Sip1调控的髓鞘基因和BMP等相关通路
2.3.4 Sip1调节少突胶质细胞分化相关因子的启动子区域
2.3.5 Smad7是少突胶质细胞内Sip1的下游基因
2.3.5.1 Smad7表达在野生型小鼠脊髓腹侧部的少突胶质细胞内
2.3.5.2 Sip1和Smad7在OLs内表达明显增多
2.3.5.3 Sip1直接调控Smad7的表达
2.3.5.4 Smad7过表达拮抗Sip1基因缺失引起的OPC分化障碍
2.3.6 Smad7协同Smurf1调控BMP和Wnt信号通路
2.3.7 Smad7促进少突胶质细胞相关标记物的异位表达
2.3.8 Smad7敲除能抑制髓鞘基因生成
3 讨论
参考文献
综述
参考文献
作者简介及在读期间所取得的科研成果
本文编号：2897428
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